氢气对慢性低氧高二氧化碳大鼠学习记忆障碍的干预作用*

杨秀艳, 邵蒙蒙, 金 露, 袁 海, 王小同

(温州医学院附属第二医院脑科，康复中心，浙江 温州325027)

氢气对慢性低氧高二氧化碳大鼠学习记忆障碍的干预作用*

杨秀艳, 邵蒙蒙, 金 露, 袁 海, 王小同△

(温州医学院附属第二医院脑科，康复中心，浙江 温州325027)

目的观察氢气(H2)对慢性低氧(O2)高二氧化碳(CO2)模型大鼠学习记忆的干预作用。方法将通过八臂迷宫训练的24只清洁级雄性SD大鼠随机分为常氧对照组(NC)、低O2高CO2+生理盐水组(MS)、低O2高CO2+H2(MH)，每组8只。NC组于常温常压条件下饲养，MS组和MH组置于O2浓度9%-11% 和CO2浓度5%-6%的舱内饲养，每天8 h，每周6 d，持续4周，其余时间饲养条件与NC组相同。每天出舱后，MS组腹腔注射生理盐水，MH组腹腔注射饱和H2水，剂量均为5 mL/kg。4周后，八臂迷宫测试3组大鼠的学习记忆能力；酶联免疫吸附法检测海马8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量；分光光度计检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；显微镜下观察3组大鼠海马超微结构及神经元凋亡小体数量。结果(1)与NC组比较，MS组和MH组工作记忆错误(WME)次数增加，海马8-OHdG和血清MDA含量增加，血清SOD活性降低，海马部位细胞结构排列紊乱，尼氏体形状和数量均有改变，凋亡细胞明显增多。(2)与MS组相比，MH组WME次数减少，海马8-OHdG和血清MDA含量降低，血清SOD活性增加，细胞结构较整齐，尼氏体丰富完整，凋亡神经元数量明显减少。结论H2改善低O2高CO2大鼠学习记忆障碍，可能与减少神经元凋亡和氧化应激损伤有关。

氢； 低氧高碳酸血症； 学习记忆功能； 八臂迷宫； 氧化性应激； 大鼠

慢性阻塞性肺气肿(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统的常见病多发病,严重威胁我国人民的身体健康。流行病学调查显示,2006年我国40岁以上人群COPD发病率为8.2%，在我国约有超过3800万患者。COPD是多因素诱发的疾病如粉尘、炎症、氧化应激、缺氧等，低氧(O2)高二氧化碳(CO2)是COPD最重要的病理生理机制[1]，我们课题组用低O2高CO2环境制作COPD动物模型发现：慢性低O2高CO2环境损伤了动物的学习记忆功能[2]，其损伤机制与氧化应激、凋亡、炎症等因素有关，但未见较有效的干预措施。

氢气(H2)是一种无色、无嗅、无味的气体。2007年，Ohsawa等[3]报道2%H2可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子，显著改善脑缺血再灌注损伤。Cai等[4]用饱和H2水治疗轻中度脑缺血缺氧损伤的新生大鼠，证明H2可明显改善缺血缺氧模型大鼠的神经功能和学习记忆能力。本实验用慢性低O2高CO2环境模拟COPD发病过程，观察H2对COPD模型大鼠认知功能障碍的干预作用。

材 料 和 方 法

1材料

常压氧舱及气体浓度监测仪(长沙华曦电子科技有限公司)；压缩高纯度氮气(N2)，浓度>99．99%(温州市申鹿气体公司)；八臂迷宫实验设备(温州医学院神经生物研究所)；全自动酶标分析仪(宝特EL×800)；722可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；H2水(浓度为上海第二军医大学潜水医学教研组提供，属于该单位专利成果)； 8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG) ELISA试剂盒购于R&D公司；尼氏染色液(北京中杉生物科技有限公司)；TUNEL试剂(Roche试剂盒)。

2方法

2.1动物分组及模型制备[5](1)34只清洁级雄性SD大鼠 (温州医学院实验动物中心提供)，体重280-310g，6-8月龄，经八臂迷宫训练后淘汰10只。达标的24只大鼠遵循随机原则分为3组：空白对照组(normal control,NC)；低O2高CO2+生理盐水组(hypoxia-hypercapnia+saling,MS)、低O2高CO2+H2组(hypoxia-hypercapnia+hydrogen,MH)。(2)将MS组和MH组大鼠置于常压低O2高CO2氧舱内(充入N2和CO2维持舱内O2浓度9%-11%，CO2浓度5%-6%，温度23-26 ℃，湿度50%-70%)，每天8 h，每周6 d,共4周；其余时间同NC组于正常环境中饲养，动物自由摄食摄水，在动物出舱后，MS组腹腔注射生理盐水，MH组腹腔注射饱和H2水，剂量均为5 mL/kg(据体重调整注射剂量)。

2.2八臂迷宫测试[6]造模前训练大鼠的记忆能力,训练前2 d限制大鼠饮食，使其体重降至原来的85%左右，在整个训练期间限食并维持原来体重的85%左右不变(饵片配方:奶粉6 mg,乳糖23 mg,低取代羟基纤维素 2.5 mg,硬脂酸镁0.5 mg,滑石粉1 mg,糖粉17 mg。经制粒后,压片机压成 50 mg /片)。大鼠在迷宫中预适应2 d，每天1次，第1 d在八个臂中均撒上饵片任其自由摄食10 min，第2 d在固定的四臂中放置饵片(1、2、4、7臂)，任其在迷宫中寻找食物10 min。训练时，固定在1、2、4、7臂中放置饵片不变，将大鼠放于迷宫中央区，任其自由摄食。大鼠进入放饵片的臂并摄取食物为1次正确的选择不做记录，再次进入放饵片的臂称为工作记忆错误 (working memory error，WME)，进入不放饵片的臂称为参考记忆错误 (reference memory error，RME)，两者之和为总的记忆错误 (total memory error，TE)。训练成功的标准：连续5次训练WME均为零，RME≤1次。记录参数为WME、RME及TE。动物常压低氧氧舱造模4周后，按上述方法对3组大鼠进行测试，记录参数同上，记录的数据为实验结果。

2.3取材 动物经八臂迷宫测试完毕后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取新鲜血，加适量肝素，3 000 r/min离心10 min，取血清测超氢化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，然后生理盐水灌注，分离大鼠双侧海马组织，一侧常规脱水石蜡包埋，制作厚度为5 μm石蜡切片；另一侧选取1 mm×1 mm×1 mm固定于戊二醛溶液中用作电镜观察，EPON812包埋，LKB-V型超薄切片机切片，锇酸染色，H-600型透射电镜观察脑超微结构改变，剩余部分加适量PBS匀浆，12 000 r/min离心10 min后取上清，酶联免疫吸附法测量8-OHdG含量。

2.4血清SOD活性和MDA含量测定 用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD活性(样本量30 μL)，用硫代巴比妥酸法测定血清MDA含量(样本量100 μL)。具体操作按试剂盒说明书进行(试剂盒购自南京建成生物工程研究所)。

2.5海马8-OHdG含量测定 采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 8-OHdG 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 8-OHdG与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠8-OHdG，形成免疫复合物连接在板上。辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450 nm处测A值，8-OHdG浓度与A值成正比，绘制标准曲线即可求出标本中8-OHdG浓度。

2.6尼氏染色 取上述制作好的石蜡切片，常规脱蜡水化，然后将切片放入尼氏染色液10 min，无水乙醇分化5 s，透明，封片；光镜下观察，结果判读：尼氏体为核周呈块状(形如虎斑)或颗粒状紫蓝色小体，每张切片随机选取5个高倍视野，统计尼氏体数量(单位：个/高倍视野)。

2.7TUNEL染色 取上述制作好的石蜡切片，常规脱蜡水合，PBS液冲洗2次，加入2‰蛋白酶K工作液，37 ℃水浴箱反应半小时，PBS液冲洗2次，随机选取2张切片设立阳性和阴性对照，其余切片在每个标本滴加50 μL TUNEL反应液，37 ℃水浴箱避光温浴1 h，后PBS冲洗5次，抗淬灭封片剂封片，避光放置。结果判读：将处理好的标本置于荧光显微镜下观察(激发波长450 nm，发射波长550 nm)，阳性细胞为核周染色质浓缩呈明亮点状的黄绿色细胞，每张切片随机取5个高倍视野，统计阳性细胞个数(单位：个/高倍视野)。

3统计学处理

结 果

1H2对低O2高CO2模型大鼠学习记忆的影响

与NC组(WME 0.13±0.12;TE 2.00±0.30)相比，MS和MH组WME(分别为1.88±0.26和0.88±0.29)、TE(4.13±0.25和2.50±0.52)均有增加 (P<0．05)，RME亦增加，但无显著差异(P>0.05)；与MS组比较，MH组WME和TE均明显减少，见表1。

表1各组八臂迷宫实验的结果

GroupWMERMETENC0．13±0．121．88±0．292．00±0．30MS1．88±0．26◆2．25±0．264．13±0．25◆MH0．88±0．29★1．63±0．252．50±0．52★

◆P<0.05vsNC group；★P<0.05vsMS group.

2海马8-OHdG、血清MDA含量和血清SOD活性结果

与NC组相比，MS组8-OHdG含量[(137.369±7.589)μg/L]和MDA含量[(4.613±1.545)μmol/L]明显增加，SOD活性[(19.803±3.650)×103U/L]降低(P<0.05);与MS组比较，MH组的8-OHdG含量[(123.389±6.041)μg/L]和MDA[(3.165±0.978)μmol/L]含量减少，SOD活性[(28.850±4.900)×103U/L]增强(P<0.05);MH组与NC组相比，8-OHdG和MDA含量增加，SOD活性增强，但无显著差别，见表2。

表2各组8-OHdG、MDA含量及SOD活性水平

Group8-OHdG(μg/L)MDA(μmol/L)SOD(103U/L)NC113．146±5．9533．068±1．41924．608±3．787MS137．369±7．589★4．613±1．545★19．803±3．650★MH123．389±6．041◇3．165±0．978◇28．850±4．900◇

★P<0.05vsNC group;◇P<0.05vsMS group.

3病理

3.1光镜观察 NC组组织结构排列有序,轮廓清晰,结构完整,尼氏体位于核周,数量丰富，结构完整、染色均匀，着色较深，凋亡细胞偶见；MS组组织结构紊乱,细胞轮廓尚清,尼氏体数量显著减少,结构不规整，凋亡细胞较多见；MH组组织结构排列基本有序,细胞轮廓清晰,染色稍浅，尼氏体数量MS组较丰富，结构基本完整，个体较小，凋亡细胞数目较MS组明显减少 (各组切片平均每高倍视野下尼氏体和凋亡细胞数见表3、镜下图片见图1、2)。

3.2电镜观察 海马神经元细胞核：NC组细胞核呈圆形,核膜光滑，核仁清晰可见,染色质呈细颗粒状，分布均匀；MS组细胞核固缩，外形不规则，核膜模糊，核仁更加致密； MH组细胞核轻度水肿，呈椭圆形，核膜基本光滑，染色质均匀，核仁清晰可见。NC组细胞浆内线粒体、内质网、高尔基体等细胞器丰富，结构清晰完整；MS组胞浆电子密度增高，细胞器明显减少，结构模糊，MH组胞浆内细胞器丰富，结构完整，电子密度较NC和MS组减低,见图3。

表3各组尼氏小体和凋亡细胞定量分析

GroupNisslbodyApoptoticcellsNC8．608±2．0870．463±0．132MS5．103±1．650★8．737±1．672★MH9．650±1．912◇3．144±1．014◇

★P<0.05vsNC group;◇P<0.05vsMS group.

Figure 1. The morphology and number of Nissl body in hippocampus tissues with Nissl staining in the three groups( light microscope,×400).

图1尼氏染色显示3组大鼠海马组织尼氏体的形态和数目

Figure 2. Neuronal apoptosis(green) in hippocampus tissues detected by TUNEL staining (fluorescence microscope,×400).

图2TUNEL染色显示3组大鼠海马组织凋亡细胞数量

Figure 3. The nucleus morphology of hippocampus neurons by electron microscopy(×6 000).

图3电镜下3组大鼠海马组织神经元细胞核形态

讨 论

慢性低氧可导致大脑的线粒体、溶酶体损伤，进而影响细胞能量代谢，使ATP生成减少；严重缺氧时神经细胞膜电位降低，神经递质合成减少，脑细胞能量代谢障碍，细胞膜通透性增加等上述因素使中枢神经系统功能受损[7]。缺氧可加重大鼠海马氧化应激损伤，诱导海马凋亡相关基因表达，促使海马神经元迟发型死亡，从而加重认知功能损害[8]。本实验研究发现低O2高CO2环境下大鼠记忆功能受损，脑组织脂质氧化产物MDA和DNA氧化产物8-OHdG生成增多，超氧化物歧化酶SOD活性降低，海马组织结构稳定性破坏，尼氏体减少，凋亡细胞增大，反映了低O2高CO2环境使大鼠机体氧化应激反应增强，组织结构紊乱，神经元凋亡增加，从而影响其神经功能和学习记忆能力。

本实验给予低O2高CO2模型大鼠腹腔注射饱和H2生理盐水的方法发现：H2能够显著改善低O2高CO2模型大鼠学习记忆障碍，推测H2的保护作用主要通过以下机制：(1)减轻DNA、脂质氧化应激损伤，增强超氧化物歧化酶SOD活性；(2)维持神经元结构和形态的稳定，减少神经元凋亡，从而保证神经抗氧化，而且能够保护脑组织形态结构的稳定性，减少神经元凋亡，从而改善大鼠的学习记忆能力。目前，由于技术、设备等原因，动物模型尚不能监测体内H2浓度，这也是我们以后研究H2作用机制必须要攻克的难题。

H2是人体内的生理物质之一，无毒副反应[9]。将H2在高压装置下溶于生理盐水避免了爆炸的危险，方便运输和使用。一系列动物实验证明，H2对结肠炎[10]、肝炎、缺血再灌注[11]、器官移植后排斥反应[12]等动物模型均有明显保护作用。本实验发现H2可改善低O2高CO2所致的大鼠模型学习记忆障碍，为预防、治疗认知障碍提供了新的方法和思路,也为拓展H2的应用领域提供了初步理论依据。H2改善认知功能障碍的确切机制有待进一步研究。

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Interventionofhydrogenonmemorydamageinducedbychronichypoxia-hypercapniainrats

YANG Xiu-yan, SHAO Meng-meng, JIN Lu, YUAN Hai, WANG Xiao-tong

(CenterofNeurologyandRehabilitation,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325027,China.E-mail:wangxt22@163.com)

AIM: To investigate the effects of hydrogen on the memory damage caused by chronic hypoxia-hypercapnia in rats.METHODSTwenty-four SD rats trained by eight-arm radial maze test were randomly divided into 3 groups:normal control group (NC), hypoxia-hypercapnia+saline group (MS) and hypoxia-hypercapnia+ hydrogen group (MH). The rats in the latter 2 groups were placed in a closed cabin for 8 h/day,6 days/week and lasted for 4 weeks, in which O2was 9%-11% and CO2was 5%-6%. In every time after the animals were out of the cabin, the MS rats were intraperitoneally injected with saline (5 mL/kg) and the MH rats were intraperitoneally injected with hydrogen solution at the same dose. The learning and memory function, the activity of superoxide dismutase (SOD), the content of malondialdehyde (MDA) and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) were examined after the cabin training. The ultramicrostructures of hippocampus were also observed.RESULTS(1) Compared with NC group, the number of working memory errors, the total errors, the content of hippocampus 8-OHdG and serum MDA in MS and MH groups were higher and the activity of serum SOD was lower (P<0.05). The hippocampus structure was destroyed and some degree of edema and more apoptosis in the neurons were obserued in MS group and MH group. (2) Compared with MS group, the number of working memory errors(WME), the total errors, the content of hippocampus 8-OHdG and serum MDA were lower and the activity of serum SOD was higher in MH group (P<0.05). In MH group, the morphology of hippocampus structures kept nearly normal arrangement and the only mild edema and fewer apoptosis in the neurons were found.CONCLUSIONHydrogen may attenuate chronic hypoxia-hypercapnia-induced memory damage in rats by inhibiting apoptosis of the neurons and decreasing detrimental free radicals reaction.

Hydrogen; Hypoxia hypercapnia; Learning memory function; Eight-arm radial maze; Oxidative stress; Rats

R363

A

1000-4718(2011)03-0566-05

2010-10-27

2010-12-31

浙江省自然科学基金资助项目(No.Y205233); 温州市科技局资助项目(No.Y2005A001)

△通讯作者 Tel：0577-86699362；E-mail：wangxt22@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.028