流式细胞仪的使用与维护

2011-10-23王淑静郝建民毕建杰常仲乐崔言顺

中国现代教育装备 2011年11期

关键词：亚群淋巴细胞仪器

王淑静郝建民毕建杰常仲乐崔言顺

山东农业大学山东泰安 271018

流式细胞仪的使用与维护

王淑静郝建民毕建杰常仲乐崔言顺

山东农业大学山东泰安 271018

介绍了流式细胞仪的结构、工作原理及软件的主要功能，在仪器的维护保养方面进行了详细地叙述。结合笔者工作实际，介绍了用流式细胞仪对鸡外周血淋巴细胞亚群分析结果。

流式细胞仪；流动室；细胞分选系统；淋巴细胞

Abstract: This article describes the structure of f ow cytometry, how it works and the main functionality of the software, in the area of maintenance of the instrument are described in detail. In conjunction with our own actual work, the author analyzed the results by f ow cytometric peripheral blood lymphocyte subsets in chicken.

Key words: f ow cytometry; mobile off ce; cell sorting system; lymphocyte

EasyCyte Mini Guava流式细胞仪,适用于各种流式细胞学检测分析,如动物、昆虫、酵母、原代培养、转化细胞、悬浮和贴壁细胞以及荧光微球等。采用固态蓝色或绿色激光,四色、三色或两色荧光检测,前向散射检测,可选配侧向散射；有自冲洗系统,保证流动通路畅通。EasyCyte Mini Guava流式细胞仪采用微毛细管流动技术,无需鞘液,特别适合于传染性危险生物样品的分析,山东农业大学动物疫病防治重点实验室主要用于细胞绝对计数,CD4/CD8细胞计数,免疫细胞分析,细胞标记蛋白表达检测如GFP等。结合笔者多年使用该仪器的工作经验,对流式细胞仪的工作原理、使用与维护介绍如下：

1 流式细胞仪的主要构造和工作原理

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的高科技,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞的功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA和RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析；能够分类收集(分选)某一亚群细胞,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

(1)流式细胞仪主要由5部分构成：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统；光学系统；信号检测与存储、显示、分析系统；细胞分选系统。

(2)流式细胞仪工作原理（如图1所示）。

图1 流式细胞仪工作原理

2 仪器软件的主要功能

Guava流式细胞仪的主软件是CytoSoft,用于控制仪器、获取细胞和分析数据,相当于一个操作平台。在此操作平台上共有10个分析模块用于具体的实验：

(1)Express分析软件,所有的流式实验都可以使用这个软件来获取细胞和分析数据,用户有更大的自主控制权,包括设置参数、多色荧光的补偿、设“门”、选择点图或直方图,可以根据实验的具体情况来设计。Guava EasyCyte Mini配Express Plus软件。(2)Viacount分析软件：用于活细胞计数,可以检测每单位体积内活细胞的含量和死细胞的含量,为后续实验取用的样品量提供依据,也可以监测细胞的生长状态。(3)Nexin分析软件：用于细胞凋亡的分析。(4)MultiCaspase分析软件：用于细胞凋亡的分析。(5)Tunel分析软件：用于细胞凋亡的分析。(6)Mitopotential分析软件：用于细胞凋亡的分析。(7)Cell Cycle分析软件：用于细胞周期的分析。(8)Cell Paint分析软件：考察被荧光标记的活细胞在反应体系中的分布。(9)Cell Toxicity分析软件：用于细胞毒性分析实验,分别给出效应细胞和靶细胞在反应体系中的变化。(10)CellGrowth分析软件：用于细胞增殖分析实验,可以考察5代细胞的数量。我们主要使用(1)(2)(7)3个分析软件。

3 EasyCyte Mini Guava流式细胞仪保养与维护

(1)在每天实验结束后和实验过程中(当样品很多时),按规定运行“Quick Clean”“Clean”或“Clean & Shutdown”,防止液流通路的阻塞。当样品是血样或其他直接来自动物组织的细胞样品,杂质较多的时候样品要先过滤,并在实验过程中适当增加清洗的次数。为了彻底清洗液流系统,每天实验结束需要运行2遍清洗和关机程序。在清洗结束后,始终保留一个去离子水管在Guava PCA上。

(2)当怀疑液流通路被堵塞或封闭时,可以在每个实验界面或Guava Check界面,点击Backflush(倒冲)按钮,为避免污染未检测的样品,需要移开上样管中的样品管。移除样品管,装载上20%漂白剂。Backflush结束后,加入1管去离子水,点击“Quick Clean”。如果在运行Guava Check时进行Backf ush,直接用水倒冲系统。

(3)用注射式洗涤工具清洗流动室。移出流动室时,操作要小心。一定不要碰触毛细管,其易碎。千万不要将流动室装置用力放入底座中。在试图移出流动室前,为了避免暴露于激光辐射中,要关闭Guava PCA电源。

(4)每打开一个Guava程序应使激光器预热5分钟。

(5)建议每次实验进行Check beads检测,确保仪器参数在正常范围,若较长时间没有使用该仪器,必须先进行Check beads检测,以确保系统运行正常。

(6)勿将Guava的ICF,Bleach(漂白剂,5%次氯酸钠)或其他清洁剂放在EasyCyte Mini仪器中过夜或时间过长。长时间暴露在强氧化剂中会损伤毛细管。

(7)当清洗瓶中的ICF只有1/4瓶时,需要在清洗瓶中加入ICF。清洗液通过瓶中的管子进行吸取。不要使清洗瓶空置,这会导致流动池中有气泡产生,需要重新用水冲洗系统。

(8)关机时记住在EasyCyte Mini仪器中放置1管去离子水。定时更换装水的管子。

(9)每天实验结束或需要时,要倒空废液瓶。

4 应用实例

淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群,各亚群的数量和功能发生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以通过对不同的淋巴细胞亚群数量的测定来监控病体的免疫状态,指导治疗。图2和图3是FCM测定鸡外周血淋巴细胞亚群分析结果。

图2

图3

图2是鸡外周血淋巴细胞亚群的前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)组成的点阵图,根据forward scatter与side scatter确定待检测的淋巴细胞门。

图3为用anti-CD4Mab-FITC和anti-CD8Mab-PE对所选淋巴细胞进行标记后的淋巴细胞分群(左上：CD4 T细胞亚群；右下：CD8 T细胞亚群)。此二维点阵图是细胞的2种荧光(FITC和RD1)双参数数据显示,横坐标和纵坐标均是对数的,横坐标代表FITC,纵坐标代表PE,图中已设定适当的“门”(十字门)。

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Use and maintenance of f ow cytometry

Wang Shujing, Hao Jianmin, Bi Jianjie, Chang Zhongle, Cui Yanshun Shandong agricultural university, Tai'an, 271018, China