要重视微小RNA在HCV感染和防治研究中的作用

陈 智

(浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所、传染病诊治国家重点实验室，浙江杭州310003)

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是引起慢性肝病的主要原因之一，全球约有HCV感染者1.7亿人。HCV感染后，约50% ～85%的感染者不能有效清除病毒而发展为慢性丙型肝炎，其中20% ～30%发展为肝硬化，1% ～5%转为肝细胞肝癌(HCC)，严重危害人类健康［1］。目前，国内外尚无能够有效预防HCV感染的疫苗问世。临床上对丙型肝炎推荐采用聚乙二醇长效α-干扰素(Peg-IFN-α)联合利巴韦林(Ribavirin)进行治疗，其疗效与病毒基因型和宿主基因多态性(如IL-28B位点)密切相关［2］。HCV基因1型患者经该方案治疗1年后，仍有约一半的患者不能产生持续病毒学应答(sustained virological response，SVR)［3］。最近虽然用小分子物质如Telaprevir+标准RGT方案进行治疗，疗效有所提高，但仍有不少问题需要进一步解决。因此，研究其相关的机制，选择合理的药物靶点，对研发新的高效抗病毒药物具有十分重要的意义。

近年来，HCV假病毒颗粒(HCV pseudotype particles，HCVpp)［4］及 HCV 细 胞 培 养 体 系(HCV grown in cell culture，HCVcc)［5］的建立，大大推动了对HCV生命周期和生物学基础的认识。一系列治疗新靶点的发现，衍生出利用这些新型病毒酶抑制剂、免疫调节分子、抗体、反义RNA和治疗性疫苗的丙型肝炎治疗新策略，以及微小 RNA(microRNAs，miRNAs)调节HCV复制的功能［6-9］，均成为研究者关注的热点。

1 miRNA与丙型肝炎发病机制

越来越多的研究显示，miRNA与病毒感染的过程密切相关。首先，丙型肝炎患者肝脏中有多种 miRNAs表达异常。Peng等运用miRNA芯片技术对丙型肝炎患者肝组织和正常肝组织的miRNA表达水平进行了比较分析，发现，前者 miR-122、miR-320、miR-193、miR-181、miR-296等miRNA表达下调，而miR-215、miR-16、miR-26、miR-130、miR-199、miR-155 等的表达上调，认为这些miRNA可能与HCV感染及丙型肝炎的发展具有密切关系［10］。Grek等人和Bihrer等人的临床研究分别显示，丙型肝炎患者的外周血单个核细胞(PBMC)和血清中也存在多种miRNAs的异常表达［11-12］。鲁兖等人基于Huh-7.5.1细胞HCV感染模型的研究发现，有13种 miRNAs(miR-10a、miR-149、miR-181a、miR-193a-3p、miR-200b、miR-210、miR-301b、miR-340、miR-365、miR-425、miR-616和miR-629及miR-99b)在HCV感染后表达上调，而有7种 miRNAs(miR-100、miR-140-5p、miR-148a、miR-152、miR-21 和 miR-27a及 miR-339-5p)则在HCV感染后表达下调，提示这些差异表达的miRNAs可能也与HCV的复制相关［13］。

这些微小RNA的表达变化与丙型肝炎病毒的复制水平以及丙型肝炎发病机制有较为密切的关系。例如，miR-122是肝脏特异性的miRNA，由肝控制区基因非编码区(hcr)转录加工而成，在肝脏发育过程中起着重要的调节作用，约占整个肝脏表达的 miRNA总量的70%［14］。通过与 HCV 5＇-NCR 的两个靶位点相结合，miR-122可上调HCV复制水平，是最早发现的与HCV复制相关的宿主miRNA［15］。而朱蕾等人的研究发现，miR-122可调节乙型肝炎病毒抗原表达，并可能潜在地影响HBV发病机制［16］。Banaudha等人发现 miR-141也能促进HCV复制，同时miR-141能沉默肿瘤抑制分子DLC-1，因此，miR-141可能与HCV感染导致HCC发生有关［17］。Ishida等人的研究显示，miR-192/miR-215和miR-491与HCV的复制相关，miR-491通过PI3K/Akt途径影响HCV的复制［18］。另外，有研究发现，miR-196和 miR-199a能抑制HCV-1b或-2a复制子细胞模型中HCV 的复制［19-20］。

2 miRNA与丙型肝炎靶向治疗

鉴于miR-122和miR-141等对HCV复制有正调控作用，有望在临床上开发出针对HCV感染的miRNA靶向治疗策略。我们可通过传统的反义技术来抑制miR-122功能，但传统反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)效率低下，因此常需借助体外修饰，如2＇-O-甲基化 (2＇-OMe)、 MOE (2＇-O-methoxyethyl phosphorothioate)、肽核酸 (peptidenucleic acids，PNA)或 2＇-Fluoro/2＇-OMe 嵌合修饰来提高其效率［21-24］。锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)修饰是最新的一种手段。研究发现，对HCV感染的黑猩猩输注LNA-antimiR或SPC3649(miR-122的互补LNA-修饰核苷酸)后，其肝细胞可摄入LNA-antimiR或SPC3649而抑制miR-122功能，进而抑制HCV复制，同时并未发现明显的副作用［25-26］。相反，已知miR-199a和miR-196能抑制HCV的复制，因此过表达miR-199a或miR-196也可作为一种临床策略。

3 miRNA作为丙型肝炎临床诊治和预警监测指标的意义

Marquez等人对丙型肝炎患者肝组织和正常肝组织的miR-122、miR-21表达水平，与临床指标进行了关联分析，发现miR-21表达水平与病毒滴度、纤维化程度和血清ALT、AST水平呈正相关，而miR-122表达水平与纤维化程度和血 清 ALT、 AST 水 平 呈 负 相 关［27］。Bandyopadhyay等人发现，丙型肝炎患者肝组织中miR-29的表达下调，而miR-29可抑制肝星状细胞(HSC)的增殖和分泌胶原，因此，miR-29可能与慢性丙型肝炎患者的纤维化进程相关［28］。另有报道，慢性丙型肝炎患者的PBMC中miRNA-155和miRNA-196b表达水平与HCV RNA载量相关［9］。血清中 miR-122表达水平与丙型肝炎患者血清ALT指标和炎症活动度呈正相关［10］。

上述研究结果显示，丙型肝炎患者较之健康人，其肝脏、PBMC和血清中存在多种microRNAs的表达差异，尤其是其血清或PBMC中的差异miRNAs，有望作为丙型肝炎病情进展和肝硬化的新型预警及监测指标。

4 miRNA作为丙型肝炎抗病毒治疗预后评价指标的意义

最近的几项临床研究显示，miRNAs与丙型肝炎患者的干扰素(IFN)治疗应答也存在一定关联。Sarasin-Filipowicz等人的研究表明，miR-122的表达在IFN-α难治型HCV患者的肝脏中明显下调［29］。Murakami等人发现，IFN治疗后获得SVR的患者与无应答(non-responder，NR)的患者相比，肝脏中 9种miRNAs的表达水平有明显不同，其中，4种miRNAs(miR-27b、miR-378、miR-422b和 miR-122)的表达水平SVR组要明显高于NR组，而另外 5 种 miRNAs(miR-34b、miR-145、miR-143、miR-652和miR-18a)的表达水平SVR组要显著低于NR组［30］。Scagnolari等人的研究发现，健康志愿者和慢性丙型肝炎患者的PBMC在体外经 IFN刺激后，miR-1、miR-30、miR-128、miR-196和 miR-296的表达均上调，但其上调程度两组间有差异，而且这5种miRNAs的上调比例在 SVR组中要高于 NR组［31］。根据序列预测分析，这5种 miRNAs在HCV基因组中均有靶点［32］。鲁兖等人进一步对HCV感染细胞模型加干扰素干预后的mi-RNA表达谱进行了分析，发现13种miRNAs在HCV感染后表达上调，但在干扰素干预后出现下调;而另外7种miRNAs在HCV感染后表达下调，而在干扰素干预后发生上调，提示这些差异表达的miRNAs可能也与丙型肝炎患者IFN应答相关［11］。另外，李苏娟等研究了miR-122对IFN-α抗HCV效应的影响，发现在HCV细胞感染模型中，miR-122模拟物呈剂量依赖性促进HCV RNA复制，而IFN-α的抗病毒效应与HCV载量呈反比，显示miR-122可能通过影响HCV载量而影响IFN-α的抗HCV效应［33］。

上述研究结果显示，miRNAs在IFN应答和无应答患者间存在差异，联合分析某些特异的miRNAs，有望作为丙型肝炎患者抗病毒治疗效果的一种新型的预后评价指标。

5 miRNA研究中存在问题与研究方向

综上所述，miRNAs的表达失调与丙型肝炎的病毒感染及疾病进展密切相关，因此，研究基于miRNA调控的HCV临床治疗新策略具有十分重要的意义。然而，由于一种miRNA能调控多种靶基因，miRNA的生物学功能常不能仅从其单一靶基因作出推断。虽然miRNAs靶基因可通过计算机模拟分析来确定，但该技术也仅能预测约50%的调控靶点。另外，miRNAs能通过联合调控一系列靶点，而影响某种特定表型，即表型常由多个靶点来共同调控。miRNAs对单个mRNAs靶点的调控效应是部分的，而多个靶点的共同调节会产生协同的表型改变。因此，当miRNA应用于临床时，其靶点的选择和其他宿主因素尚需慎重考虑。

目前，miR-122的抑制物已进入I期临床研究阶段，有望成为第一种基于miRNA的临床治疗策略，但其安全性和有效性正在作进一步临床观察。同时，对于这种特殊小分子的合理选择和有效修饰及高效运输等方面，还有待进一步深入研究。随着对miRNAs研究的深入，一些以miRNA为靶点的试剂和新药将不断涌现，从而开辟对丙型肝炎临床诊断和治疗的新领域。

［1］SHEPARED C W，FINELLI L，ALTER M J.Global epidemiology of hepatitis C virus infection［J］.Lancent Infect Dis，2005，5:558-567.

［2］GE D，FELLAY J，THOMPSON A J，et al.Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatmentinduced viral clearance ［J］.Nature，2009，461(7262):399-401.

［3］ZEUZEM S，POORDAD F.Pegylated-interferon plus ribavirin therapy in the treatmentofCHC:individualization of treatment duration according to on-treatment virologic response ［J］.Curr Med Res Opin，2010，26(7):1733-1743.

［4］BARTOSCH B，DUBUISSON J，COSSET F L.Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes［J］.J Exp Med，2003，197(5):633-642.

［5］LINDENBACH B D，EVANS M J，SYDER A J，et al.Complete replication of hepatitis C virus in cell culture［J］.Science，2005，309(5734):623-626.

［6］PAWLOTSKY J M.Therapy of hepatitis C:from empiricism to eradication［J］.Hepatology，2006，43(2 Suppl 1):S207-220.

［7］JOPLING C L，YI M，LANCASTER A M，et al.Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA ［J］.Science，2005，309(5740):1577-1581.

［8］XING Xiao-kang，HE Ji-liang，CHEN Zhi(邢小康，何继亮，陈 智).Inhibition of hepatitis C virus replication by smallinterfering RNA in cells infected byHCV ［J］.JournalofZhejiangUniversity:Medical Sciences(浙江大学学报:医学版)，2011，40(6):582-587.(in Chinese)

［9］LIU Yan-ning，LOU Guo-hua，CHEN Zhi(刘艳宁，楼国华，陈 智).Research advances on treatment of hepatitis C infection based on RNA interference and microRNA modulation ［J］.Journalof Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大学学报:医学版)，2011，40(6):609-616.(in Chinese)

［10］PENG C，LIY，WALTERSK A，etal.Computational identi cation of hepatitis C virus associated microRNA-mRNA regulatory modules in human livers ［J］.BMC Genomics，2009，10:373.

［11］GREK M，PIEKARSKA A，BARTKOWIAk J，et al.Coordinated increase ofmiRNA-155 and miRNA-196b expression correlates with the detection of the antigenomic strand of hepatitis C virus in peripheral blood mononuclear cells［J］.Int J Mol Med，2011［Epub ahead of print］.

［12］BIHRER V， FRIEDRICH-RUST M，KRONENBERGER B，et al.Serum miR-122 as a Biomarker of Necroinflammation in Patients With Chronic Hepatitis C Virus Infection ［J］.Am J Gastroenterol，2011［Epub ahead of print］.

［13］LU Yan，XING Xiao-kang，SONG Guang-zhong，et al(鲁 兖，邢小康，宋广忠，等).Alteration of mi-RNA expression profile after interferon treatment in HCV-infected Huh7.5.1 cells［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大学学报:医学版)，2011，40(6):598-602.(in Chinese)

［14］CHANG J，NICOLAS E，MARKS D，et al.MiR-122，a mammalian liver-specific microRNA，is processed from hcr mRNA and may downregulate the high affinity cationic amino acid transporter CAT-1 ［J］.RNA Biol，2004，1(2):106-113.

［15］JOPLING C L，SCHUTZ S，SARNOW P.Positiondependent function for a tandem microRNA miR-122-binding site located in the hepatitis C virus RNA genome ［J］.Cell Host Microbe，2008，4(1):77-85.

［16］ZHU Lei，CHEN Zhi，CHEN Jian-zhong，et al(朱蕾，陈 智，陈建忠，等).Effects of miR-122 on expression of hepatitis B virus proteins［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大学学报:医学版)，2011，40(6):593-597.(in Chinese)

［17］BANAUDHA K，KALISZEWSKI M，KOROLNEK T，et al.MicroRNA silencing of tumor suppressor DLC-1 promotes efficient hepatitis C virus replication in primary human hepatocytes［J］.Hepatology，2011，53(1):53-61.

［18］ISHIDA H，TATSUMIT，HOSUIA，etal.Alterations in microRNA expression profile in HCV-infected hepatoma cells:Involvement of miR-491 in regulation of HCV replication via the PI3 kinase/Akt pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011［Epub ahead of print］.

［19］HOU W，TIAN Q，ZHENG J，et al.MicroRNA-196 represses Bach1 protein and hepatitis C virus gene expression in human hepatoma cells expressing hepatitis C viral proteins［J］.Hepatology，2010，51(5):1494-1504.

［20］MURAKAMI Y，ALY H H，TAJIMA A，et al.Regulation ofthe hepatitis C virus genome replication by miR-199a［J］.J Hepatol，2009，50(3):453-460.

［21］SHAN Y，ZHENG J，LAMBRECHT R W，et al.Reciprocal effects of micro-RNA-122 on expression of heme oxygenase-1 and hepatitis C virus genes in human hepatocytes［J］.Gastroenterology，2007，133(4):1166-1174.

［22］ESAU C，DAVIS S，MURRAY S F，et al.MiR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting［J］.Cell Metab，2006，3(2):87-98.

［23］FABANI M M，GAIT M J.miR-122 targeting with LNA/2＇-O-methyl oligonucleotide mixmers，peptide nucleic acids(PNA)，and PNA-peptide conjugates［J］.RNA，2008，14(2):336-346.

［24］BHAT B，ESAU C，DAVISS，etal.2＇-OMethoxyethyl/2＇-Fluoro modified oligonucleotides result in more potent inhibition of micro RNA-122 in vivo:a target implicatedin HCV replication［J］.Nucleic Acids Symp Ser，2008，52(1):69.

［25］ELMEN J，LINDOW M，SCHUTZ S，et al.LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates［J］.Nature，2008，452(7189):896-899.

［26］LANFORD R E，HILDEBRANDT-ERIKSEN E S，PETRI A，et al.Therapeutic silencing ofmicroRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection ［J］.Science，2010，327(5962):198-201.

［27］MARQUEZ R T， BANDYOPADHYAY S，WENDLANDT E B，et al.Correlation between microRNA expression levels and clinical parameters associated with chronic hepatitis C viral infection in humans ［J］.Lab Invest，2010，90(12):1727-1736.

［28］BANDYOPADHYAY S， FRIEDMAN R C，MARQUEZ R T，et al.Hepatitis C virus infection and hepatic stellate cell activation downregulate miR-29:miR-29 overexpression reduces hepatitis C viral abundance in culture ［J］.J Infect Dis，2011，203(12):1753-1762.

［29］SARASIN-FILIPOWICZ M， KROL J，MARKIEWICZ I，etal.Decreased levelsof microRNA miR-122 in individuals with hepatitis C responding poorly to interferon therapy［J］.Nat Med，2009，15(1):31-33.

［30］MURAKAMI Y，TANAKA M，TOYODA H，et al.Hepatic microRNA expression is associated with the response to interferon treatment of chronic hepatitis C ［J］.BMC Med Genomics，2010，3:48.

［31］SCAGNOLARI C，ZINGARIELLO P，VECCHIET J，etal.Differentialexpression ofinterferoninduced microRNAsin patientswith chronic hepatitis C virus infection treated with pegylated interferon alpha［J］.Virol J，2010，7:311.

［32］PEDERSEN I M，CHENG G，WIELAND S，et al.Interferon modulation of cellular microRNAs as an antiviral mechanism ［J］.Nature，2007，449(7164):919-922.

［33］LI Su-juan，ZHU Hai-hong，CHEN Zhi(李苏娟，朱海红，陈 智).Influence of miR-122 on IFN-α treatment for HCV infection ［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大学学报:医学版)，2011，40(6):588-592.(in Chinese)