基于RNA干扰技术和MICRORNA调控的丙型肝炎治疗研究进展

刘艳宁，楼国华，陈 智 综述

(传染病诊治国家重点实验室、浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所，浙江杭州310003)

1 丙型肝炎治疗现状

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是导致肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一，全球约有1.7亿人感染了HCV，中国人群HCV感染率约3.2%，估计全国感染者在4000万以上，其中50%～85%的感染者不能有效清除病毒而发展为慢性丙型肝炎(慢丙肝)［1］。慢丙肝及其终末期肝病(肝硬化、肝癌)是肝移植的常见适应证，但是移植后常会发生HCV的再次感染而导致肝病复发。令人遗憾的是，尚无针对HCV感染的有效疫苗或抗体。目前常规的治疗丙肝的方案是Peg-IFN-α联合利巴韦林，但其疗效与病毒基因型及病毒滴度密切相关，仍有约一半的患者不能产生持续病毒学应答(SVR)而清除病毒。另外，干扰素和利巴韦林的昂贵费用及其严重的副作用也限制了它们的使用。

HCV细胞培养体系的建立加速了对HCV生物学基础的认知。近年来一系列治疗新靶点的发现，衍生出利用这些新型病毒酶抑制剂、免疫调节分子、抗体、反义RNA或治疗性疫苗的丙肝治疗新策略。在这些新手段中，RNA干扰(RNA interference，RNAi)是抗病毒治疗中最具前景的方法之一。

RNAi由21个核苷酸的siRNA启动，能直接以化学合成的siRNAs形式导入细胞，也可间接以双链RNAs的形式由载体导入细胞，能在转录后水平序列特异性地抑制基因的表达。dsRNAs或shRNAs首先被Dicer酶切割成具有活性的siRNA，然后这些siRNA组装成多组分的复合物，即RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物再与一条作为靶向引导序列的单链siRNA相结合，继而沉默对应的 mRNA［2］。这种简单、有效、特异的基因沉默体系大大加速了HCV治疗新靶点的发现，同时也加速了治疗新方法的发展。另外，近期研究发现宿主细胞内源microRNAs(miRNAs)具有调节HCV复制的功能，这有望作为一种极具前景的新型治疗手段［3］。下面对 HCV治疗中基于 RNAi和miRNA的抗病毒策略的发展现状和前景作一综述。

2 RNAi在丙肝治疗中的应用

2.1 病毒靶点 HCV全基因组包括5＇和3＇端的非编码区(non-coding region，NCR)，和一个开放阅读框(ORF)，编码4种结构蛋白(E1，E2，core，p7)和 6 种非结构(NS)蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。HCV 可分为6 个基因型(1 ［a，b，c］，2［a，b，c］，3［a，b ］，4a，5a，6a)及70多个亚型，各基因型核苷酸序列间具有31%～34%的差异，亚型间具有20%～25%的差异。由于HCV是单股正链RNA病毒，其基因复制需要先合成全长负链RNA中间体，然后负链RNA再作为模板而合成新的正链RNA。NS5B是 HCV RNA依赖的 RNA聚合酶，它是合成正、负链基因组所必需的。病毒5＇NCR的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)与40S核糖体亚基相结合，进而启动HCV病毒蛋白的合成［4］。

RNA病毒基因组既作为病毒mRNA，又要作为病毒复制的模板，因此，HCV基因组是RNAi的敏感靶点。又因为HCV复制多在细胞质中进行的，因此使其对 RNAi更为敏感。IRES是HCV基因组中最为保守的序列，所以它可以作为RNAi的理想靶点。有研究显示，在细胞模型中导入针对IRES的siRNA能降低HCV感染颗粒的释放［5］。另外，HCV结构和非结构蛋白中的保守区域也能作为RNAi的靶点。近年来，多项研究显示针对HCV非结构序列(NS3，NS4B，NS5A 和 NS5B)［6］和 HCV IRES域的RNAi都能有效抑制HCV的复制［7］。

NS5B缺乏校对功能，因此HCV具有高突变率，并且慢丙肝患者中HCV复制率较高，这就形成了不计其数的准种，从而使得HCV能逃逸序列严格限定的RNAi作用［8］。已有研究发现，在siRNA作用压力下，HCV的siRNA靶序列中产生了具有点突变的复制子［9］。

2.2 宿主细胞靶点 HCV细胞培养体系的发展，加速了对HCV生活史及其与宿主细胞联系间的认识。研究发现多种宿主分子在HCV感染中具有重要意义，如 CD81、SR-BI、Claudin-1和occludin等［10-13］，这些宿主因素共同作用于病毒感染的各个环节。另外还发现，许多宿主分子与病毒复制相关，如F-box、FBL-2、VAP-A、VAP-B、FKBP8 和热休克蛋白等［14-16］。基于单个靶点的RNAi以及基于多个靶点的全基因筛查技术大大加快了对HCV治疗新靶点的发现，多数新发现的宿主分子参与了信号转导，基因转录，蛋白合成和RNAi途径，但其具体机制尚待进一步研究。

哺乳动物DNA聚合酶具有高保真的校对功能，而使宿主基因变异率要远低于HCV，因此针对宿主基因的RNAi能较好的回避突变逃逸。例如，通过RNAi敲除CD81，能大大降低HCV E2蛋白结合到人肝癌细胞上［17］。最近有研究显示，抗CD81的抗体能保护人肝-uPASCID小鼠免受多种 HCV毒株的感染［18］。利用RNAi下调Huh7细胞中SR-BI的表达，可明显抑制 HCV假病毒颗粒的感染［19］。与 HCV非结构蛋白(如NS5A和NS5B)功能相关的宿主细胞基因，也可作为抑制病毒复制的RNAi靶点［20］。

虽然抗病毒治疗中的RNAi可把上述宿主分子作为靶点，但该策略有一个明显的弊端，即可能对肝细胞的内稳态产生严重的副作用。所有已确认的宿主分子都对肝细胞功能有重要作用，沉默这些基因可能对肝细胞功能和存活产生负面效应。因此，在把这些宿主分子作为临床治疗靶点之前尚有待进一步研究。

2.3 动物模型 虽然最早是在黑猩猩模型上发现了HCV，但大规模利用其作为实验动物会受到伦理学和高成本的制约。在小鼠或大鼠中植入含亚基因组HCV复制子或是感染病毒颗粒的肝癌细胞可以作为替代模型，但是这种肿瘤模型与天然感染模型仍有较大差异［21-22］。近来，嵌合体小鼠模型的发展促进了HCV病毒学和抗病毒治疗的研究。这种免疫缺陷小鼠模型携带了小鼠uPA基因(该基因能引起严重的肝脏毒性)，移植人肝细胞后，可在小鼠体内构建人源性肝脏，从而能被HCV感染［23］。然而，该免疫缺陷小鼠模型并不适用于研究抗HCV的或针对RNAi和基因治疗载体的免疫应答。

通过在小鼠肝脏中共转抗NS5B的shRNA表达质粒，以及荧光素酶(luciferase)-NS5B融合质粒，已经证实 RNAi具有抗 HCV的作用［24］。但 RNAi的临床疗效仍需在合适的动物模型中进行验证。更加稳定和易于操控的小动物模型的发展，将对于在人源性的免疫环境中进行HCV感染机制和抗病毒治疗的研究具有重要意义。

3 siRNA和shRNA的肝靶向传递

3.1 化学合成的siRNA RNAi在丙肝治疗中的应用，需要有效的肝脏靶向运输系统。研究早期，广泛应用化学合成的siRNAs，但其存在许多缺陷，如细胞渗透性差，易于降解，以及脱靶后产生的负面作用等［25］。因此，肝脏靶向性的实现需要采用经过适当修饰的裸天然siRNA。

已经发现一些化学修饰能改善siRNA的特性，如寡核苷酸链、锁核酸(LNA)、2＇-修饰的RNA、4＇-thio修饰的 RNA和核苷酸 mimics等［26］。化学修饰能显著提高 siRNAs的稳定性，增强其肝靶向性，并提高其基因沉默效力，同时降低细胞毒性和免疫刺激副作用。另一种策略是把 siRNAs交联到小分子或蛋白上，siRNA与抗体、维他命A-脂质体或阳离子脂质体相结合后，具有肝脏靶向性的RNAi运输作用［27-28］。肝特异性的配体与修饰后的siRNAs相结合后能进一步提高其靶向性，从而降低副作用和非特异性。

3.2 载体表达的shRNA RNAi只有实现长效和稳定的沉默，才能作为慢丙肝的治疗方案。基于基因治疗载体表达的shRNA能产生相对长效和持久的沉默。多数基因治疗载体是经过修饰的病毒，目前RNAi运输中使用最多的病毒载体是腺病毒、腺相关病毒和慢病毒等。

腺病毒载体是最早发现的载体系统，能有效导入增殖的细胞。最近研究发现，尾静脉注射表达HCV shRNA的腺病毒载体，能特异性地抑制HCV转基因小鼠肝脏中HCV基因组RNA和蛋白的合成［29］。但在临床应用中仍面临一些担忧，其中主要的障碍是针对腺病毒载体的免疫反应。RNAi运输的另一个问题是，腺病毒高表达小的非编码RNAs，会以竞争性底物的形式占据Dicer和RISC复合物进而干扰RNAi途径［30］。最新的第三代腺病毒载体已克服了上述缺陷，载体中所有病毒编码序列均被填充DNA和转基因替代［31］。最新研究表明，第三代腺病毒载体携带的shRNA能抑制肝脏中靶基因的表达，但高水平的shRNA表达会激活干扰素应答［32］。腺相关病毒(AAV)载体也能用于shRNA的运输。虽然AAV血清型2(AAV2)是最先发现的用于基因运输的AAV，但针对AAV2的免疫反应制约了其临床应用。AAV8是新发现的AAV家族成员，它不易被已有的人类抗体所识别，并能使shRNA的运输效率提高近百倍［33］。通过构建自身互补的AAV载体进一步改进了单链AAV载体特性，它能在脱壳后退火形成稳定的具有转录活性的DNA二聚体［34］。

慢病毒载体来源于HIV-1，它与其它载体的不同在于它能整合入宿主基因，因此能介导shRNA的长效表达。然而，来源限制以及潜在的安全问题限制了其临床应用。目前新开发的第三代VSV-G假病毒HIV-1和HIV-2载体，能克服上述问题。第一代shRNA由聚合酶III启动子来表达，这常导致shRNA过表达而引起急性细胞毒性反应［35］。而第二代shRNA模拟了pri-miRNA的结构，因此能通过聚合酶II启动子来表达［36］，从而提高了其安全性。

慢丙肝晚期常需进行肝移植，但如何防止丙肝复发仍是临床面临的巨大问题。病毒载体介导的RNAi，能通过对移植物进行操作而避免HCV复发。在肝移植前需多次灌注来清除肝脏血液。肝脏的体外灌注为肝靶向性的基因治疗提供了绝佳机会。早期研究证实，对冷冻保存的大鼠肝脏移植物以复制缺陷腺病毒载体进行体外灌注，能提高转基因的摄入和表达［37］。慢病毒载体具有稳定并长期表达shRNA的能力，因此，利用灭活的慢病毒载体，介导RNAi而保护肝脏移植物免受HCV的再次感染是最为合适的。

4 microRNAs在HCV感染中的作用

4.1 microRNAs对HCV复制的调控 越来越多的研究显示miRNA参与了病毒感染，miR-122是最早被发现的与HCV复制相关的宿主miRNA［3］。miR-122 能与 HCV 5＇NCR 的两个靶位点相结合，该结合是病毒复制所必需的。这两个miR-122结合靶点由一序列保守的短片段相间隔。但该靶点与普通的miRNA靶序列完全不同，通常情况下 miRNA靶向结合3＇NCR而导致 mRNA的抑制或降解［38］。然而，把HCV miR-122结合位点插入报告基因mRNA的3＇NCR后，则会引起该mRNA表达下调，这表明miR-122结合位点的定位在基因调节中具有重要意义［39］。

此外，miR-122还能通过调控血红素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)的表达而间接影响HCV复制，HO-1是一种能抑制HCV复制的关键酶［40］。最近研究发现，miR-122通过在翻译起始阶段增强核糖体与病毒RNA的结合而刺激 HCV 复制［41］。研究还发现，IFN-β 能调节多种包括miR-122在内的细胞miRNAs的表达，其中有8种 miRNAs根据序列预测在HCV基因组中具有靶点。这些发现表明，哺乳动物能利用细胞miRNAs的干扰机制来对抗病毒感染［42］。近期有一项临床研究显示，miR-122的表达在IFN-α难治型的HCV患者中明显下调，进一步证实了IFN应答与miRNA间的联系［43］。而 Yoshiki等人的最新研究显示，miR-122a在获得持续病毒学应答(SVR)的丙肝患者的肝组织中的表达水平要高于无病毒学应答(NR)的患者，提示miR-122a可能也与患者的IFN应答相关［44］。另外，最近研究还发现miR-199a能抑制 HCV 复制［45］。

4.2 miRNAs的临床靶点 miRNAs是HCV生活史中一类新的细胞分子。miR-122对HCV复制起正向调节作用的这一发现，以及现有的操控miRNA功能的技术手段，为针对HCV感染的miRNA靶向治疗策略的发展提供了基础。我们可通过传统的反义技术来抑制miR-122功能，该手段能在多个水平影响miR-122，如通过结合成熟的pre或pri-miR-122而阻断其功能。然而，传统反义核苷酸 (antisense oligonucleotides，ASO)效率低下，常需要通过另外的修饰来提高其生物效能。2＇-O-甲基化(OMe)的ASO对两种HCV亚基因型细胞模型中HCV RNA抑制率可达84%［40］。此外，MOE(2＇-O-methoxyethyl phosphorothioate)修饰也能有效抑制肝脏中miR-122活性［46］。

锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)修饰是最新的一种手段。LNA其部分核糖上的2＇与4＇碳基经亚甲基桥连结在一起，使得其与互补核酸链的配对更为迅速并提高了其结合的稳定性［47］。研究发现灵长类动物输注LNA-antimiR后，其肝细胞可摄入 LNA-antimiR，并在 LNA-antimiR和miR-122间形成稳定的杂交双链，从而抑制肝脏miR-122功能，但并未发现LNA相关的细胞毒性或是组织病理学改变［48］。

miR-122沉默还能通过肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)或 2＇Fluoro/2＇OMe 嵌合修饰的ASO来实现。把反义PNA交联到一种细胞穿膜肽上以后，无需转染即能抑制人和大鼠细胞系中的miR-122，这突显了其临床应用的优势［49］。而 2＇Fluoro/2＇OMe 嵌合的 antimiR-122 ASO具有更高的效率，与LNA ASO相比其效率提高了5～10倍［50］。相反，已知 miR-199a能抑制病毒的复制，因此，过表达 miR-199a也可作为一种临床策略［44］。

5 RNAi临床应用的限制因素

5.1 耐药和突变逃逸 与已有的单一抗病毒治疗手段一样，单纯RNAi治疗也难以完全控制感染，从而可能形成耐药准种。因此，成功控制HCV感染需采用联合治疗策略。RNAi的严格序列特异性存在一个缺点，即HCV靶序列单个核苷酸的突变就能破坏其识别和沉默作用，但可通过同时靶向多个病毒序列而避免该问题。内切酶加工后的siRNAs能同时靶向HCV基因组的多个位点，从而避免逃逸并有效抑制HCV 复制子的复制［51］。另外，多靶点的siRNAs也能通过Dicer酶切割天然的或载体携带的双链长RNA而得到［52-53］。

第二种策略是同时针对病毒和宿主基因序列。已经发现，细胞蛋白酶α亚基7(PSMA7)和HuR能与HCV相结合［54-55］。联合应用靶向PSMA7-和 HuR-的 siRNAs与靶向 HCV 的siRNAs，可对HCV复制子产生进一步的抗病毒效果［56］。同样，联合采用靶向HCV RNA和靶向CD81的shRNAs，能同时干预病毒侵入和复制两个环节［57］。三倍体 shRNA盒由三个 H1启动子启动，它与单一的shRNA相比能更加有效地抑制HCV复制，以及由CD81介导的E2结合。

IFN-α具有间接的抗病毒能力，它通过激活非病毒特异性的抗病毒基因而发挥作用。因此，联合应用RNAi和IFN-α可避免治疗性耐药，并具有更好的抗病毒效果。研究发现慢病毒介导的RNAi和IFN-α能独立抑制HCV复制，两者的抗病毒效果不会产生相互影响［58］。泛素特异蛋白酶18(ubiquitin specific protease 18，USP18)的上调与患者的IFN治疗不应答相关，研究发现沉默USP18能提高IFN的抗HCV效果，提示联合运用RNAi和IFN-α具有可行性［59］。另外，联合运用 RNAi与利巴韦林、核酶、ASO或小分子抑制剂的可行性也有待进一步研究。

5.2 病毒对RNAi的干扰 与其它多种病毒一样，HCV也能通过多种机制来破坏RNAi的抗病毒作用。已经发现表达HCV多蛋白后，siRNA介导的基因沉默可被抑制。HCV结构蛋白E2通过与RISC复合物中的Argonaute-2(Ago-2)相结合而抑制 RNAi［60］。还有人发现HCV核心蛋白也能抑制shRNA介导的基因沉默，进一步研究显示，其核心蛋白N端的62个氨基酸与RNAi抑制相关［61］。

6 展望

大量研究表明，RNAi在了解HCV生物学特性及作为临床治疗策略方面具有重要意义。通过RNAi筛查方法已确认诸多宿主分子参与了病毒生活史的多个阶段，为了解病毒-宿主相互作用提供了重要依据，并揭示出很多潜在的治疗靶点。miR-122作为HCV复制的正调节因子的发现，使人们对开发基于ASO的临床治疗策略产生了浓厚兴趣。然而，miRNA靶点的选择和其他宿主因素尚需慎重考虑，因为至今对其生理学功能尚未完全了解。

虽然HCV RNA基因组是RNAi的靶点，但基于单一RNAi的靶向治疗策略常由于其高突变率，遗传多样性，复杂的基因结构，以及病毒对RNAi的抑制等方面原因，而达不到预期效果。因此，选择多个病毒靶点，或联合病毒靶点和宿主分子靶点，甚至与传统治疗方式相结合，将有助于提高疗效。随着基因运载技术的进步，运用RNAi治疗丙肝显示出美好前景。当然，在正式应用于临床前，还需借助HCV的小动物模型来进一步评价RNAi在体内的长期疗效，免疫能力等，以填补体外实验研究与患者临床治疗间的空隙。

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