抗苗勒激素对ICSI治疗中卵巢反应的预测价值

韩巍巍，Schaffrath M，Holze V，Pollow K，Seufert R，童晓文

(1.同济大学附属同济医院妇保中心，上海 200065;2.德国美因茨大学医院妇产科生殖中心，德国美因茨 55101)

自1978年第1例试管婴儿诞生以来，辅助生殖技术发展迅速，目前已有上百万的患者成功孕育了胎儿。随着年龄的增长，卵巢储备(卵巢内原始卵泡的数量和质量)降低，试管婴儿(in vitro fertilization，IVF)的成功率逐渐下降。抗苗勒激素(anti-Müllerian hormone，AMH)被认为是抑制始基卵泡的募集和早期生长卵泡发育的重要因子之一。

为了研究控制性超排卵过程中血清与卵泡液中AMH水平对治疗反应性的预测价值，本研究检测了促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone-agonist，GnRH-a)长方案以及GnRH拮抗剂联合方案治疗不同阶段血清和卵泡液中AMH水平，分析其与控制性超排卵治疗后各项临床指标的相关性。探讨AMH作为卵巢反应性的一种新的监测指标的可能性及其对控制性超排卵用药的指导作用。

1 资料与方法

1.1 控制性超排卵

参与实验的53例患者在德国美因茨大学医院妇产科生殖中心接受ICSI治疗。采用GnRH-a长方案进行控制性超排卵治疗的共40例，采用GnRH拮抗剂联合方案的共13例。53例共分为4组:没有胚胎植入组(6例)、胚胎种植失败组(34例)、生化妊娠组(5例)、临床妊娠组(8例)。测定患者血清及卵泡液中 AMH、E2、孕酮(progestone，P)水平。所有患者均签署参与治疗及实验的知情同意书，本次实验研究获得美因茨大学道德委员会的批准。

在GnRH-a长方案促排卵过程中，在治疗前一周期黄体中期(第18～21天)给予长效GnRH-a进行降调节，当完全降调节达到时，即血清E2≤50 pg/ml，第2天开始给予重组卵泡刺激素(recombinant FSH，rFSH)。在GnRH拮抗剂联合方案中，在月经第2天给予rFSH，治疗第7天开始应用GnRH拮抗剂。rFSH的初始剂量为150～300 IU/d(根据年龄、体质量指数、既往促排卵治疗反应决定初始剂量)。通过B型超声检查和血E2的测定，监测卵泡发育情况并调整rFSH的剂量。当B超监测优势卵泡≥18 mm，或有两个卵泡≥17 mm时，注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)5000～10000 IU，促使卵泡成熟。34～36 h后，在静脉麻醉状态，B超引导下进行穿刺取卵术，并立即在显微镜下取出卵细胞，移到含胚胎培养液的培养皿中，置37℃培养箱中培养。取卵后4～6 h，MⅡ期的卵子(出现第一极体)行 ICSI，成功后置于5%CO2，37℃培养箱。取卵16～18 h后出现两个原核和两个极体，标志体外受精成功。取卵3 d后对受精卵细胞数量、核外碎片程度，以及卵裂球对称均匀程度对受精卵进行评分，选取2～3个受精卵植回患者体内。取卵14 d后检测血-HCG，阳性为生化妊娠。胚胎种植6周后B超检测到宫内孕囊、胚芽和原始心管搏动，诊断为临床妊娠。在取卵后对患者给予孕酮(600 mg/d)支持，如果确定为妊娠，继续补充孕酮到第10周，自第10周起减少剂量为400 mg/d，继续补充至第12周。

1.2 血清和卵泡液中激素水平测定

在GnRH-a长方案促排卵治疗的40例患者中，rFSH应用第2天抽取静脉血5 ml。在全部53例患者中，OPU当天抽取静脉血5 ml，并收集优势卵泡的卵泡液。标本稳定于室温20 min后，3000 r/min离心10 min，离心半径6 cm，吸出上清液装入无菌试管置入－20℃冰箱冻存备检。AMH ELISA试剂盒用来检测AMH含量。应用自动酶免疫分析仪检测E2、P含量。

1.3 统计分析

2 结 果

2.1 一般情况

53例患者的临床资料，见表1。体质量指数(body mass index，BMI)、基础 FSH、rFSH 用量、受精率在4组间无显著性差异。临床妊娠组的患者年龄显著低于没有临床妊娠组(P=0.017)。年龄与获卵数呈明显负相关(总获卵数:P＜0.001，r=－0.535;MⅡ成熟卵数:P ＜0.001，r= －0.470)。

表1 患者的一般资料及接受促排卵治疗后的各项临床指标Tab.1 Comparison of clinical and pretreatment parameters in undergoing ovarian stimulation

2.2 血清及卵泡液中各项激素水平比较

53例患者血清及卵泡液中各项激素检测结果见表2。在GnRH-a长方案治疗组与GnRH拮抗剂联合方案治疗组，OPU当天血清AMH水平无显著性差异(GnRH-a长方案组:1.1 ±1.3 ng/ml，GnRH拮抗剂联合方案组:0.7 ±0.6 ng/ml，P=0.341)，卵泡液中AMH水平在两组间表达也无明显差异(GnRH-a长方案组:2.1 ±2.1 ng/ml，GnRH 拮抗剂联合方案组:1.6 ±0.8 ng/ml，P=0.378)。

2.3 AMH水平与临床各项指标的相关性

AMH水平与各项指标相关性见表3，GnRH-a长方案促排卵治疗中，治疗初始血清AMH水平与患者年龄、总rFSH用量呈负相关，与获卵总数、成熟卵数呈正相关。治疗初始血清AMH水平与E2水平呈正相关(P=0.027，r=0.329)，与 P 水平无明显相关性。

表2 血清及卵泡液中各项激素水平Tab.2 Comparison of follicular fluid and serum concentrations of hormones in undergoing ovarian stinulation

表3 血清及卵泡液中AMH水平与临床各项指标的相关性Tab.3 Correlation between hormone levels and clinical parameters by statistical analysis

53例患者OPU当天血清AMH水平与患者年龄、总rFSH用量呈负相关，与总获卵数、成熟卵数呈正相关。OPU当天血清AMH水平与E2水平呈正相关(P=0.012，r=0.364)，与 P 水平无明显相关性。OPU当天血清E2水平与获卵数呈正相关(总获卵数:P＜0.001，r=0.682;成熟卵数:P＜0.001，r=0.667)。

OPU当天卵泡液中AMH水平与患者年龄、总rFSH用量呈负相关，与总获卵数、成熟卵数呈正相关。卵泡液中AMH水平与OPU当天血清AMH水平呈正相关(P ＜0.001，r=0.570)。

3 讨 论

目前，全球不孕夫妇正呈逐年上升趋势，不孕不育症的发病率为15% ～20%。1978年，第1例体外受精的婴儿在伦敦诞生，辅助生殖技术迅速发展，并广泛应用于不孕症的临床治疗方面。今天，在辅助生殖技术中广泛应用控制性超排卵技术(controlled ovarian hyperstimulation，COH)。其理想的条件包括:用药物对卵巢进行超常的刺激以得到适当多数目的卵子，得到高质量的卵子;用药后体内的内分泌环境及子宫内膜条件要适合胚胎的着床、生长、发育;尽量减少副作用如卵巢过度刺激综合征;整个过程可以被人们所调控。在治疗过程中，卵巢对促性腺激素的反应是临床成功的关键因素，因此在患者进行昂贵的辅助生殖治疗(assisted reproductive technology，ART)前评估卵巢储备功能，在治疗过程中监测，预测卵巢反应性，有重要的临床意义，可以帮助临床医生筛选患者，制定个体化的治疗方案，减少卵巢过度刺激综合征和卵巢低反应的发生，获得最佳的治疗结果。

AMH又称苗勒抑制物质(Müllerian inhibiting substance，MIS)，是转化生长因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)家族的成员，由两个相同的70 kb亚基组成的二聚糖蛋白。在对动物［1］及人类［2-3］的研究中发现，AMH仅由性腺合成。它主要表达于胎儿的睾丸组织，起促进男性生殖道的分化作用。出生后，在女性，AMH由卵巢颗粒细胞产生，在新生儿期体内几乎测不到，到性成熟后达最高水平，绝经后又消失。在自然月经周期中，募集的卵泡少，发现AMH水平在整个月经周期中波动极小，呈相对稳定状态［4］。近期的研究表明AMH是可以预测卵巢储备及控制性超排卵治疗后卵巢反应的一个重要因子［5-7］。在对雌鼠的研究中发现，AMH抑制始基卵泡的募集，阻止卵泡池的消耗［8］，同时还可抑制卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)依赖性的窦前卵泡生长［7］。Weenen证实人类卵巢中AMH的表达类似于啮齿目动物［9］。与其他反应卵泡状态的因子不同，AMH仅有卵巢颗粒细胞分泌。研究表明窦卵泡计数与月经第3天血清AMH水平密切相关，超过与基础FSH、抑制素B(inhibin B，INHB)、E2(estradiol)的相关程度。另外，在促排卵治疗过程中，血清AMH水平逐渐下降，可能反映了由于超排卵而引起小窦卵泡数目的急剧减少，肯定了较大卵泡缺乏AMH的表达［10］。

卵巢储备随着妇女的年龄增长而下降，卵巢皮质区卵泡逐渐减少。相关研究［11］对年龄≥41岁的接受IVF/ICSI治疗的431例患者进行分析，结果表明41～43岁患者每一次采卵的成功分娩率为2%～7%，≥44岁患者无1例成功分娩，≥45岁患者无1例成功妊娠。Templeton证实年龄可以预测IVF的结局［12］。本研究也发现，患者年龄与总获卵数、成熟卵数呈负相关，显然年龄是影响ART治疗结局的一个重要因素。

研究显示，月经周期第3天AMH水平可以预测促排卵治疗的卵巢反应性及卵巢储备［5-6，13］。基础 AMH 水平与卵巢反应性呈正相关［6，14-15］，与获卵数呈正相关，且相关性明显高于基础AMH水平与基础FSH、抑制素B的相关性［16］。控制性超排卵过程中，AMH的动态变化与自然周期不同［17］。促排卵过程中AMH水平可以更好地预测卵巢反应性［18］。Penarrubia 等［19］证实，GnRH-a 长方案促排卵过程中，初始阶段血清AMH水平在周期取消组明显偏低，辅助生殖治疗第5天的AMH水平比基础AMH水平能更好地预测周期取消率。控制性超排卵中AMH水平能够反应卵细胞的质量和卵巢反应性［20］。本研究中，GnRH-a长方案控制性超排卵过程中，早卵泡期血清AMH水平与患者年龄、总rFSH用量呈负相关，与总获卵数、成熟卵数呈正相关。小窦卵泡的AMH含量明显高于排卵前卵泡AMH含量，表明血清AMH水平主要反应小窦卵泡的数量［21］。在COH过程中，多个卵泡发育，血清AMH水平逐渐下降，可能反应了由于促排卵导致的小窦卵泡数量的进行性下降［22］。La Marca等［23］发现，在女性生育后期，血清 AMH 水平下降，在绝经期，即使用十分精密的测量方法，仍无法检测到AMH水平。这些证据更加说明AMH可以预测卵巢储备。与基础AMH水平相比，COH早卵泡期的血清AMH水平，在外源性促性腺激素作用下，对卵巢反应性有更好的预测价值。

本研究中，在GnRH-a长方案与GnRH拮抗剂联合方案促排卵治疗中，OPU当天AMH水平无明显差异，提示在GnRH-a长方案与GnRH拮抗剂联合方案促排卵过程中，卵泡发育的微环境，AMH以及其他激素的分泌无明显差别［24］。本研究中，OPU当天血清AMH水平与总获卵数、成熟卵数呈正相关。Wunder等［25］也得出相同的结论。相关研究对33名GnRH-a长方案+ICSI治疗患者进行研究，发现在黄体中期，促排卵早卵泡期，以及排卵期血清AMH水平与获卵数呈正相关，黄体中期与早卵泡期的AMH水平能更好的预测临床妊娠［26］。本研究发现OPU当天卵泡液中AMH水平与年龄、总rFSH用量呈负相关，与总获卵数、成熟卵数呈正相关，并且与当天血清AMH呈正相关。最近一项研究［25］表明，在COH治疗受孕组，OPU当天卵泡液中AMH水平明显高于未受孕组。Takahashi等［27］也证实，接受IVF治疗受精成功组卵泡液中AMH水平明显高于未成功组。

体外受精-胚胎移植技术是一项有创的，昂贵的治疗，接受治疗患者同时承受生理和心理上的压力。制定个性化的治疗方案，在治疗过程中监测卵巢反应，及时评估卵巢不良反应的发生有重要意义。目前，控制性超排卵治疗过程中常规采用B超、血清E2水平监测卵巢反应性，但仍存在较高的周期取消率和卵巢反应低下发生率。通过本研究得出的结论，在控制性超排卵治疗过程早卵泡期血清AMH水平与卵巢反应性(总获卵数和成熟卵数)呈正相关，检测治疗过程早卵泡期血清AMH水平有助于更加准确的评估卵巢反应性，预测卵巢反应低下的发生，有助于调整治疗方案，调整rFSH使用剂量，达到更好的治疗效果。因卵泡穿刺当天血清和卵泡液AMH水平，与获取卵子数量，成熟卵数均有显著相关性，考虑检测卵泡液中AMH水平操作较复杂，可以仅检测OPU当天血清AMH水平，作为参考条件之一选择胚胎植入数量，有助于避免多胎妊娠的发生。

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