工程大肠杆菌脂肪酸胞外分泌调控研究进展

孟 鑫，程 涛,2，李良智，杨建明，刘 炜，徐 鑫，咸 漠,*

(1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东 青岛 266101；2.江西理工大学材料与化学工程学院，江西 赣州 341000)

工程大肠杆菌脂肪酸胞外分泌调控研究进展

孟 鑫1，程 涛1,2，李良智1，杨建明1，刘 炜1，徐 鑫1，咸 漠1,*

(1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东 青岛 266101；2.江西理工大学材料与化学工程学院，江西 赣州 341000)

天然产油微生物产生的脂肪酸多以甘油三酯形式贮存在细胞内，需要从细胞内提取，工艺复杂、生产成本高，且严重污染环境。工程大肠杆菌定向调控生产游离脂肪酸已成为近年来的研究热点，是缓解能源危机，提供优质、低成本油脂原料的有效途径。本文从大肠杆菌脂肪酸胞外分泌相关基因(tesA、fadD、fadL)和调控蛋白(MsbA)两个方面综述脂肪酸胞外分泌调控研究进展，并提出了利用分子生物学和代谢工程手段对大肠杆菌脂肪酸代谢定向调控，生产胞外游离脂肪酸的新的研究方向。

脂肪酸；代谢调控；转运

脂肪酸是一种重要的平台化合物，广泛应用于工业、食品、医药、保健品等诸多方面，尤其是作为油脂原料在生物柴油(脂肪酸甲酯)生产中应用[1]。目前，主要是以动、植物油脂为原料生产脂肪酸[2]，但这些油脂生产受季节、地域等因素限制，生产成本高，不宜大规模工业化生产应用。微生物是有效转化秸秆等生物质资源的生物催化剂，是开发优质、低成本生物柴油的首选，已受到国内外众多学者的普遍关注[3]。微生物油脂种类繁多，脂肪酸组成与植物油脂相似，被誉为是“天然汽油”[4]。与动、植物油脂相比，微生物细胞增殖快，发酵周期短，不受场地、季节、气候变化等的影响，易于连续工业化生产。但是，天然产油微生物产生的脂肪酸多以甘油三酯形式贮存在细胞内，需要从细胞内提取，工艺复杂、生产成本高，且提取过程严重污染环境。

随着分子生物学技术的发展，通过代谢工程手段，定向调控工程大肠杆菌生产胞外游离脂肪酸，可以避免复杂的提取精炼过程，是真正降低脂肪酸生产成本，获得优质油脂原料的有效手段，具有重要的战略意义。工程大肠杆菌具有遗传背景清楚，易于工程调控，可高密度发酵等诸多优点，已经成为微生物催化合成化学品和燃料的理想受体菌。目前，工程大肠杆菌已成功用于多种脂肪酸及脂肪酸代谢衍生物的生产，像类黄酮、生物乙醇等[5-6]。最近已有研究报道，利用工程菌生产脂肪酸，但这些研究获得的脂肪酸多以胞内脂形式存在，仍需复杂的提取分离过程，而对于利用工程菌生产胞外游离脂肪酸的研究较少。本文综述大肠杆菌脂肪酸转运相关调节基因和蛋白功能的研究进展，并对工程大肠杆菌生产胞外游离脂肪酸的策略进行展望。

1 大肠杆菌脂肪代谢途径概述

在大多数细菌、植物中，脂肪酸合成是在一组高度保守蛋白的催化下完成的，这些蛋白被称为Ⅱ型脂肪酸合成酶系(FAS)[7]。大肠杆菌脂肪酸合成是一种典型的FAS系统(图1)。在所有生物体中，脂肪酸及其衍生物是机体细胞膜的重要组成部分，是能量代谢的重要动力来源，是代谢调节的重要分子，在生物体细胞代谢中发挥重要作用。在大肠杆菌细胞内，脂肪酸代谢主要包括3个过程：1)从葡萄糖出发，经糖酵解作用和三羧酸循环，为机体脂肪酸合成提供了底物acetyl-CoA；2)苹果酸酶催化苹果酸脱羧转化生成丙酮酸，并释放出能量NADPH，是脂肪酸合成的主要动力来源；3)经脂肪酸从头合成，在FAS的催化下转化生成脂酰-CoA，脂酰-CoA在硫脂酶TesA的水解作用下，释放出游离脂肪酸，进入细胞质中，或在甘油三磷酸酰基转移酶作用下生成磷脂。

图1 大肠杆菌脂肪酸代谢路径Fig.1 Metabolic pathway of fatty acids in E. coli

大肠杆菌脂肪酸转运是一个复杂的调控过程，是在多种基因和蛋白的共同调节作用下进行的，但脂肪酸转运及分泌机制尚处于探索阶段[8]。已报道一些与大肠杆菌脂肪酸转运相关的蛋白及基因家族，如硫脂酶基因[9]、Fad基因家族[10]、内膜脂类翻转酶基因[11]等。然而，若实现大肠杆菌脂肪酸胞外分泌，还需要对脂肪酸转运的多种基因和蛋白进行调控，探索脂肪酸转运可能的机制。

2 脂肪酸胞外分泌相关基因研究进展

长链脂肪酸是能量代谢和膜脂合成的重要原料，无论真核生物，还是原核生物，脂肪酸转运到细胞的特定部位都是受基因严格调控的[12]，其中，研究较多的是硫脂酶基因、Fad基因家族。

2.1 硫脂酶基因

硫脂酶(TesA，EC3.1.2)广泛存在于动植物、微生物体内，在脂肪酸合成过程中催化水解脂酰-CoA或脂酰基-ACP生成CoASH或ACP，同时释放出游离脂肪酸的反应[9]，是细胞脂肪酸合成、降解和转运的关键酶。机体代谢产生的脂肪酸是以胞内脂形式贮存，还是以游离形式存在，取决于硫脂酶活性的大小[13]。因作用底物不同，硫脂酶分为两类：以脂酰-ACP为水解底物的硫脂酶(acyl-ACP thioesterase)；以脂酰-CoA为水解底物的硫脂酶(acyl-CoA thioesterase)[14]。

大肠杆菌硫脂酶(acyl-CoA thioesterase)主要以脂酰-CoA为水解底物，释放出游离脂肪酸[15]，同时也能够水解脂酰-ACP，但酶活性较低，包括两种类型：ThioesteraseⅠ，由tesA基因编码，专一性水解12～18碳的脂酰-CoA；Thioesterase II，由tesB基因编码，专一性水解6～18碳的脂酰-CoA[16]。目前，对大肠杆菌硫脂酶基因功能已有报道，Zheng等[17]在大肠杆菌中共表达tesB和phaG基因后，发现两个基因有相互调节作用，促进了重组菌3-羟基癸酸(3-hydroxydecanoic acid)的生产。Steen等[4]研究表明，在大肠杆菌中表达内源硫脂酶基因tesA，摇瓶发酵可得到0.32g/L的游离脂肪酸。因此，可在大肠杆菌中表达硫脂酶tesA基因，释放出ACP，获得游离脂肪酸，参与脂肪酸转运，使脂肪酸以游离形式分泌到细胞外。近年来又有相关研究验证了这一结论[17]，但由于脂肪酸转运受多种酶和蛋白的调节，转运机制尚不清楚。

2.2 脂酰辅酶A合成酶基因

图2 大肠杆菌长链脂肪酸跨膜转运过程[10]Fig.2 Cross-membrane transportation process of long-chain fatty acids in E. coli

在大肠杆菌中，长链脂肪酸的转运是在功能基因fadD和fadL的共同作用下实现的[18-20](图2)。fadD基因编码脂酰辅酶A合成酶(FadD，EC 6.2.1.3)，对长链脂肪酸有较强的专一性，与细胞质膜结合不牢固。Klein等[21]指出fadD基因缺陷株不能在细胞质或细胞膜磷脂中积累任何链长的脂肪酸，这证明了脂酰辅酶A合成酶在细胞脂肪酸转运中是一个必须的重要基团。Michinaka等[16]敲除了酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的脂酰辅酶A合成酶基因fadD，细胞产生的脂肪酸以游离形式分泌到细胞外，较原始菌株相比，胞外脂肪酸含量提高了17倍。在大肠杆菌fadD基因缺陷株中表达内源硫脂酶tesA基因，重组菌胞外游离脂肪酸产量可达到0.7g/L。

2.3 外膜蛋白基因fadL

fadL基因编码外膜蛋白FadL，是调控大肠杆菌长链脂肪酸跨外膜向内膜转运的重要通道蛋白[22]。在大肠杆菌脂肪酸转运体系中，fadL基因发挥着重要作用，其专一转运细胞中10～18个碳的脂肪酸，并以10～18个碳链长的脂肪酸为底物；结合12～18碳的脂肪酸向膜磷脂转运，是脂肪酸转运的必需基因[23]。在长链脂肪酸转运过程中，长链脂肪酸与FadL结合，构像发生变化，暴露在膜蛋白通道处，易于跨膜蛋白通道转运[18]。长链脂肪酸(LCFA)是通过膜蛋白FadL的特殊转运调节机制跨越外膜运输的。当穿过外膜后，LCFA进入周质空间，同时，允许部分进入细胞内膜。FadD与内源ATP结合并主要以FadD-ATP形式存在，这一复合体可能是调控细胞内膜游离脂肪酸形成的主要调节蛋白。然而，脂肪酸借助FadL跨外膜蛋白向细胞内转运的机制目前仍不清楚。Kumar等[24]预测转运的脂肪酸碳末端主要是疏水性的和带电荷的氨基酸。Lee等[25]将芽孢杆菌Bacillus sp. strain TG43脂肪酶定位在大肠杆菌fadL基因C末端，利用fadL基因作为锚定蛋白的性质，能够有效检测大肠杆菌细胞表面的脂肪酶活性。

由此可见，fadD基因和fadL基因是大肠杆菌脂肪酸转运过程中的两个重要调节基因，利用基因敲除手段，对细胞脂肪酸转运进行定向调控，是实现大肠杆菌脂肪酸胞外分泌的有效策略。

3 脂肪酸胞外分泌相关蛋白研究进展

大肠杆菌长链游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)跨细胞膜转运到细胞质中，是细胞利用FFA的重要环节[11]。大肠杆菌是G—细菌，细胞膜由外膜和内膜两部分组成，磷脂双分子层是构成细胞膜的基本支架，使得细胞具有良好的流动性[26]，但脂肪酸是如何在内膜和外膜之间转运的一直以来是学者们讨论的焦点[27-29]。尽管目前关于大肠杆菌脂肪酸转运的研究已取得了一定进展，但细胞内的游离脂肪酸是通过简单扩散形式被动运输到细胞外，还是在膜蛋白参与下的主动运输作用[11,30]，观点不一。脂肪酸是大分子化合物，在机体中通过简单的自由扩散形式分泌到细胞外的量相对较少，而大多需要借助膜蛋白进行转运，因此，脂肪酸在膜蛋白作用下的跨膜转运机制研究受到国内外学者的关注[31-32]。脂肪酸在细胞质中形成，借助转运蛋白转运到细胞膜上发挥功能，通常是在多种膜蛋白的作用下实现的，其中，研究较多的是膜蛋白MsbA。

3.1 内膜脂类翻转酶MsbA

内膜脂类翻转酶MsbA是一种膜蛋白，由msbA基因编码，是大肠杆菌磷脂和脂质跨内膜向外膜转运的一个重要的ABC转座子[33-34]。msbA基因最早是在研究htrB基因突变株时发现的，推测msbA基因编码的蛋白参与细胞早期形成的脂质跨内膜转运[35]。X射线晶体检测表明，大肠杆菌MsbA蛋白可能具有脂质翻转酶功能，在脂质转运中起着至关重要的作用[36]。研究表明，MsbA在脂质转运中可能存在两种机制：以“flip-flop”模式(图3A)，依赖于MsbA的转运作用，新合成的脂质积累在内膜表面；以“ejection”模式(图3B)，可能不需要MsbA的转运作用，直接在MsbA的催化作用下，将脂质从内膜外表面溢出。近年来，围绕MsbA在脂质跨膜转运中的作用进行了很多研究[37-38]，但脂质跨膜转运机制仍处于探索阶段。

图3 MsbA在大肠杆菌脂质转运中功能[39]Fig.3 Possible functions of MsbA in lipid transportation in E. coli

3.2 调控脂肪酸转运的其他膜蛋白

大肠杆菌脂肪酸在细胞代谢、细胞繁殖、细胞膜组成等方面都发挥着不可替代的作用，在细胞质中合成的脂肪酸转运到细胞膜表面，是在多种膜蛋白共同调节下实现的。除了膜蛋白MsbA外，近年来又探索了与脂肪酸转运相关的其他蛋白的功能，像Skp、SurA、FkpA和DegP蛋白[39]。Wu等[40]研究表明，参与细胞表面脂多糖积累的功能蛋白有两种：与基本外膜蛋白相连的Imp蛋白和脂蛋白RlpB。尽管已鉴定了这些蛋白参与外膜蛋白形成，但在脂肪酸跨膜转运、脂肪酸定位和蛋白折叠方面的机制还需进一步探索。对大肠杆菌膜蛋白功能的研究，将有助于进一步解析原核生物脂肪酸转运机制，是今后工作的重点。

4 结 语

目前，利用工程大肠杆菌生产游离脂肪酸在国内外尚处于探索阶段。大肠杆菌生长速度快，易于代谢调控，是解决脂肪酸生产现存问题的理想宿主菌株，但正常情况下，脂肪酸多为胞内产物，几乎无胞外分泌，仍需经过复杂、耗能的提取分离过程制得，限制大规模的工业化生产应用。作为一种模式菌株，探索脂肪酸转运相关基因和蛋白功能，获得游离脂肪酸，解析脂肪酸胞外分泌机制，一直是备受国内外学者关注的问题，但由于脂肪酸转运是受多因素调控的复杂过程，这一问题目前仍处于探索阶段。

利用现代生物技术手段对大肠杆菌脂肪酸代谢途径相关基因和蛋白进行定向调控，调节脂肪酸胞外分泌能力，构建高产游离脂肪酸的工程菌株，生产游离脂肪酸，便可直接用于油脂生产，简化生产工艺，降低生产成本。当前，要获得产胞外游离脂肪酸的工程菌株，首先要从内源或异源的生物体中克隆调控脂肪酸代谢和转运的酶基因，如内源硫脂酶tesA基因、植物硫脂酶AtFatA基因、fadD基因、fadL基因，并在大肠杆菌中表达，探索基因及基因间相互作用对工程菌脂肪酸胞外分泌的影响；其次，结合蛋白质组学和绿色荧光蛋白技术，探索与脂肪酸转运相关蛋白功能，像目前研究较多的膜蛋白MsbA；然后，利用代谢组学技术，整合上述与脂肪酸胞外分泌相关的基因和蛋白，构建工程菌株，生产胞外游离脂肪酸。最近，美国学者Steen等[4]通过在大肠杆菌中表达内源和异源硫脂酶基因，并敲除fadD基因，构建了工程大肠杆菌，对工程菌脂肪酸转运相关基因进行了定向调控；同时，用工程菌种表达了水解纤维素的基因，使工程菌能够自身水解纤维素，并以纤维素水解产物作碳源，工程菌发酵可获得1g/L的游离脂肪酸，降低了脂肪酸生产成本，简化了生产工艺，目前正通过发酵条件优化，提高工程菌胞外游离脂肪酸产量，可望大规模应用于工业化发酵生产脂肪酸，有良好的工业应用前景。

通过现代生物技术手段调控大肠杆菌脂肪酸代谢，为脂肪酸工业化发酵生产提供优良菌株。这一策略不仅丰富了传统的油脂工业生产技术，而且是一条“不与民争粮，不与粮争地”的油脂生产新途径，可为食品、医药、生物液体燃料等油脂工业生产提供优质原料来源，具有良好的应用前景和现实意义。同时，对脂肪酸转运相关基因功能的探索，也可为进一步解析脂肪酸转运机制奠定理论基础。

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Research Progress in Regulation of Fatty Acid Secretion in Engineered E. coli Strain

MENG Xin1，CHENG Tao1,2，LI Liang-zhi1，YANG Jian-ming1，LIU Wei1，XU Xin1，XIAN Mo1,*
(1. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China；2. School of Materials and Chemical Engineering, Jiangxi University of Science and Technology, Ganzhou 341000, China)

Fatty acids produced by oil-producing microorganisms are stored in cells as the form of triglyceride. The extraction of these fatty acids from the cells is involved in complex processing, high production cost and serious environmental pollution.Targeted regulation for the production of free fatty acids by engineered E. coli strains is becoming one of the hottest topics in current research, which will be an effective strategy for reducing energy crisis and providing high-quality and low-cost raw materials of oil. The research progress of some genes (tesA, fadD and fadL) and regulatory protein (MsbA) related to extracellular secretion of fatty acids in E. coli has been reviewed in this paper. Meanwhile, the target regulation of fatty acid metabolism by using molecular biology and metabolic engineering strategies has been proposed, with the aim of provideing a new direction for producing extracellular fatty acids.

fatty acid；metabolic regulation；transportation

Q547

A

1002-6630(2011)05-0331-05

2010-05-25

中国科学院知识创新工程项目(KGCX2-YW-801)；国家自然科学基金项目(20872075)

孟鑫(1981—)，女，博士，研究方向为生物催化。E-mail：woxing1981@163.com

*通信作者：咸漠(1965—)，男，研究员，博士，研究方向为生物催化。E-mail：xianmo@qibebt.ac.cn