部分稀土元素对灵芝多糖和三萜类物质液体发酵的影响

姚 强，高兴喜*，宫志远，任鹏飞，仇可新，刘 岩

(1.山东省农业科学院土壤肥料研究所，山东 济南 250100；2.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；3.青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109)

部分稀土元素对灵芝多糖和三萜类物质液体发酵的影响

姚 强1，高兴喜2,*，宫志远1，任鹏飞1，仇可新2，刘 岩3

(1.山东省农业科学院土壤肥料研究所，山东 济南 250100；2.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；3.青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109)

研究5种稀土元素(镧(La)、铈(Ce)、钕(Nd)、镨(Pr)、铒(Er))对灵芝液体发酵生产灵芝多糖产量和灵芝三萜类物质的影响。结果表明：不同的稀土元素在适宜浓度时对灵芝多糖和灵芝三萜的产量均具有一定程度的促进作用。其中稀土元素镨对灵芝胞内多糖、胞外多糖和胞内三萜的生产促进作用最明显，分别在浓度为0.01、0.001mmol/L和0.1mmol/L时，使三者产量分别达到最高的772.56、452.76mg/L和398.49mg/L，分别是对照的4.67、3.05和1.91倍；而对于胞外三萜，0.001mmol/L的镧诱导效果最好，其产量达到610.08mg/L，是对照的2.03倍。可见适宜的稀土元素及浓度可显著提高灵芝多糖和灵芝三萜的生产。

稀土元素；灵芝；多糖；三萜

灵芝(Ganoderma lucidum Karst)古称瑞草，是一种名贵的药用真菌，至今已有2000多年的药用历史。现代药理学研究表明，灵芝具有免疫调节[1]、抗肿瘤[2-3]、保肝护肝[4]、抗病毒[5]等多种功效，其药理活性与其关键药效成分灵芝多糖和三萜类物质密切相关[6-7]。采用液体发酵的方法获取灵芝有效成分具有很好的工业化应用前景，然而产量偏低成为主要限制因素[8]。因此，如何有效提高灵芝等食药用菌活性物质的产量一直是人们研究的热点。

稀土元素是化学元素周期表中镧系元素及两个相关元素钪和钇的总称，具有广泛的生物学功能，能够促进植物的生长以及细胞次生代谢产物的合成[9-10]。近年来研究发现，稀土元素还能够促进蒙古口蘑[11]、杏鲍菇[12]、灵芝[13]等食用菌的菌丝生长，对红菇多糖深层发酵也具有一定的促进作用[14]。另外，在灵芝的栽培生产中，向培养料中添加稀土微肥还能够显著提高灵芝的产量[15]和品质[16]。目前，关于稀土元素对灵芝活性成分液体发酵影响的研究尚未见报道，本研究根据有关文献[9-10,13-14]，选择对植物或食用菌细胞生长和次生代谢产物合成具有明显促进作用的5种稀土元素(硝酸镧、硝酸铈、硝酸钕、硝酸镨和硝酸铒)，分别考察它们(La、Ce、Nd、Pr、Er)对灵芝多糖和三萜类物液体发酵的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝菌株Gl-01为昆嵛山野生菌株，由鲁东大学食用菌工程技术研究中心保存。

稀土元素硝酸镧、硝酸铈、硝酸钕、硝酸镨、硝酸铒 天津市光复精细化工研究所；香兰素 上海生工生物工程技术服务有限公司；齐墩果酸标准品 烟台市药品检验所；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化与发酵培养

将灵芝斜面菌种在PDA平板上活化，25℃培养7d左右，待长满平板后，用打孔器打取菌块接种于200mL PDB培养基，于25℃、150r/min振荡培养5～7d，制备液体菌种用于下一步发酵实验。

分别配制含有各稀土元素浓度梯度为0、0.001、0.01、0.1mmol/L的PDB培养基(500mL三角瓶装液量200mL)，每个浓度进行3个重复，高压蒸汽灭菌。然后按体积分数5%的接种量将灵芝种子液接入各培养基中，置于25℃、150r/min的摇床中进行发酵培养，培养时间为7d左右。

1.2.2 灵芝生物量测定

发酵结束后收集菌体，并用去离子水洗涤菌体3次，65℃烘干至恒定质量后测量干质量。

1.2.3 灵芝多糖和三萜类物质含量测定

[17]方法进行。

2 结果与分析

2.1 稀土元素对灵芝生物量的影响

图1 稀土元素对灵芝生物量的影响Fig.1 Effects of rare earth elements on biomass of Ganoderma lucidum

如图1所示，5种稀土元素对灵芝生物量体现出不同的影响，其中稀土元素铈(Ce)和钕(Nd)在不同测定浓度时都具有较明显的促进作用，且在0.01mmol/L时，促进效果最明显，与对照组相比分别提高了19.8%和19.6%；而稀土元素镨(Pr)只有在较高浓度时促进效果才显著，在浓度为0.1mmol/L时，比对照组提高了36.9%。稀土元素铒(Er)和镧(La)对灵芝生物量的作用不明显。

2.2 稀土元素对灵芝胞内多糖生产的影响

图2 稀土元素对灵芝胞内多糖产量的影响Fig.2 Effects of rare earth elements on IPS production

由图2可知，稀土元素镨对灵芝胞内多糖(intracellular polysaccharide，IPS)的产量促进效果最显著，当镨在浓度为0.01mmol/L时，胞内多糖产量达到772.56mg/L，与对照组相比提高了4.67倍；其次是稀土元素钕，在浓度0.1mmol/L时，胞内多糖产量达到514.12mg/L，是对照组的3.10倍。其他稀土元素对灵芝胞内多糖生产促进作用不显著。

2.3 稀土元素对灵芝胞外多糖生产的影响

5种稀土元素除铒之外，其他几种在适宜浓度都能促进灵芝胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)的生产，结果如图3所示。其中稀土元素镨促进效果最显著，当镨在浓度0.001mmol/L时，灵芝胞外多糖产量为452.76mg/L，是对照组的3.05倍；其次，稀土元素钕对灵芝胞外多糖生产促进效果最好，在浓度为0.01mmol/L时，产量达到355.74mmol/L，是对照组的2.40倍；稀土元素铈在浓度为0.001mmol/L时也具有较好的促进作用；而稀土元素镧和铒作用效果不显著，甚至出现高浓度抑制现象。

图3 稀土元素对灵芝胞外多糖产量的影响Fig.3 Effects of rare earth elements on EPS production

2.4 稀土元素对灵芝胞内三萜生产的影响

图4 不同稀土元素对灵芝胞内三萜产量的影响Fig.4 Effects of rare earth elements on IGT production

稀土元素对灵芝胞内三萜(intracellular triterpenoid，IGT)产量的影响因稀土元素的种类和浓度呈现不同的变化趋势，如图4所示。其中稀土元素钕、铈、镨和镧对灵芝胞内三萜的生产表现为促进作用，特别是稀土元素钕、镨和镧，促进作用显著，其中钕在浓度为0.001mmol/L，镧和镨在浓度为0.1mmol/L时，胞内三萜的产量分别达到341.05、347.59mg/L和398.49mg/L，分别为对照的1.64倍、1.67倍和1.91倍。而稀土元素铒对灵芝胞内三萜的生产不但没有促进作用，还表现为低浓度抑制。

2.5 稀土元素对灵芝胞外三萜生产的影响

稀土元素对灵芝胞外三萜(extracellular triterpenoid，EGT)生产的影响与胞内三萜呈现不同的变化趋势，如图5所示。对胞外三萜生产促进效果最好的稀土元素为镧和钕，且最佳浓度均为0.001mmol/L，相应胞外三萜产量分别达到610.08mg/L和489.22mg/L，分别为对照的2.03倍和1.63倍。而其他几种稀土元素对灵芝胞外三萜生产的促进作用不明显，甚至表现出高浓度抑制作用。

图5 稀土元素对灵芝胞外三萜产量的影响Fig.5 Effects of rare earth elements on EGT production

3 结论与讨论

本研究结果表明，稀土元素对灵芝多糖和三萜类物质液体发酵的影响，与稀土元素的种类和浓度密切相关，综合来看稀土元素镨和钕对灵芝多糖的诱导效果最好，而稀土元素钕、镧和铈对灵芝三萜诱导效果最好。李增利[14]在研究稀土元素对红菇多糖液体发酵的影响时也得出了类似的结论。相对于灵芝多糖和三萜的生产，灵芝生物量对稀土元素的诱导作用不甚敏感，甚至表现出抑制作用，这与郭丽琼等[15]、李增利等[14]的研究结果基本一致。

稀土元素的作用机制可能类似于激素，因其具有类似钙的原子结构特征和理化性质，可通过激活相应的酶系统而发挥作用[10,14]。然而，当稀土元素的浓度过高时，会呈现类似重金属离子的特性，并与膜蛋白结合抑制有关酶的活性[10]。本研究中，稀土元素镨、钕、镧等对灵芝胞外多糖、胞内多糖以及胞外三萜的合成表现出的高浓度抑制，可能正是缘于此。

本研究仅就稀土元素对灵芝菌丝生长以及灵芝多糖和三萜类物质合成的影响进行了探讨，而对稀土元素的作用机制，特别是稀土元素对灵芝多糖和三萜类物质等活性成分合成的分子机制还有待于进一步的深入研究。

参考文献：

[1] 刘高强, 王晓玲. 灵芝免疫调节和抗肿瘤作用的研究进展[J]. 菌物学报, 2010, 29(1): 152-158.

[2] SLIVA D, LABARRERE C, SLIVOVA V, et al. Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and prostate cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun, 2002, 298(4): 603-612.

[3] STANLEY G, HARVEY K, SLIVOVA V, et al. Ganoderma lucidum suppresses angiogenesis through the inhibition of secretion of VEGF and TGF-1 from prostate cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2005, 330(1): 46-52.

[4] ZHANG Guoliang, WANG Yehong, NI W, et al. Hepatoprotective role of Ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(4): 728-733.

[5] MOTHANA R A, AWADH ALI N A, JANSEN R, et al. Antiviral lanostanoid triterpenes from the fungus Ganoderma pfeifferi[J].Fitoterapia, 2003, 74(1/2): 177-180.

[6] LIU Jie, SHIMIZU K, KONISHI F, et al. Anti-androgenic activities of the triterpenoids fraction of Ganoderma lucidum[J]. Food Chemistry,2007, 100(4): 1691-1696.

[7] 林志彬. 灵芝抗肿瘤和免疫调节作用的研究进展[J]. 北京大学学报:医学版, 2002, 34(5): 493-498.

[8] 邢燕, 杨晓彤, 杨庆尧. 灵芝液体深层发酵研究进展[J]. 工业微生物,2007, 37(3): 63-67.

[9] WU Jianyong, WANG Chuangui, MEI Xingguo. Stimulation of taxol production and excretion in Taxus spp. cell cultures by rare earth chemical lanthanum[J]. J Biotechnol, 2001, 85(1): 67-73.

[10] OUYANG Jie, WANG Xiaodong, ZHAO Bing, et al. Effects of rare earth elements on the growth of Cistanche deserticola cells and the production of phenylethanoid glycosides[J]. Journal of Biotechnology, 2003, 102(2): 129-134.

[11] 陈立红, 闫伟. 稀土对蒙古口蘑(Tricholom ongolicum)及四种菌根真菌菌丝体生长的影响[J]. 内蒙古大学学报: 自然科学版, 2002, 33(3): 295-297.

[12] 杨德俊, 冯纪南, 李强国, 等. 稀土离子对杏鲍菇菌丝生长促进作用及增产效果的试验[J]. 食用菌, 2007, 29(5): 9-10.

[13] 何冬兰, 温川蓉. 镧和铈对灵芝菌丝生长的影响[J]. 中草药, 1997(11):684-686.

[14] 李增利. 稀土元素镨、钕、铒对红菇多糖深层发酵的影响[J]. 食品科学, 2007, 28(12): 312-316.

[15] 郭丽琼, 郭丽青. 稀土对灵芝生长影响的初步研究[J]. 中国药学杂志, 1999, 34(3): 155-157.

[16] 张金桐, 崔德芳, 丁起盛. 稀土元素对药用灵芝品质影响的研究[J].中国中药杂志, 1995, 20(9): 531-532.

[17] 高兴喜, 姚强, 王磊, 等. 真菌激发子对灵芝液体发酵生产多糖和三萜类物质的影响[J]. 食品科学, 2009, 30(23): 309-312.

Effects of Some Rare Earth Elements on Liquid Fermentation of Ganoderma lucidum to Produce Polysaccharides and Triterpenoids

YAO Qiang1，GAO Xing-xi2,*，GONG Zhi-yuan1，REN Peng-fei1，QIU Ke-xin2，LIU Yan3
(1. Soil and Fertilizer Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China；2. School of Life Sciences,Ludong University, Yantai 264025, China；3. School of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

In this study, the effects of some rare earth elements such as La3+, Ce3+, Nd3+, Pr3+and Er3+on the production of polysaccharides and triterpenoids by liquid fermentation of Ganoderma lucidum were explored. The results indicated that obvious stimulation effects of these rare earth elements on the production of polysaccharides and tritepenoids were observed. Moreover,Pr3+at concentrations of 0.01, 0.001 mmol/L and 0.1 mmol/L revealed the most obvious improvement on the production of intracellular polysaccharides (IPS), extracellular polysaccharides (EPS) and intracellular triterpenoids (IGT) with yields of 772.56, 452.76 mg/L and 398.49 mg/L, respectively. Compared with the control group, three components were increased by 4.67, 3.05 folds, and 1.91 folds due to Pr3+treatment. However, La3+at a concentration of 0.001 mmol/L showed a remarkable enhancing effect on EPS and the yield of EPS was up to 610.08 mg/L with a 2.03-fold enhancement. Therefore, the rare earth elements at appropriate concentrations can obviously increase the production of polysaccharides and triterpenoids in Ganoderma lucidum during liquid fermentation.

rare earth elements；Ganoderma lucidum；polysaccharides；triterpenoids

Q93.335

A

1002-6630(2011)05-0224-04

2010-07-20

山东省自然科学基金项目(Q2008D02；ZR2010CL020)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAD89B09-11)；

山东省农业良种工程项目(2007LZ06-3)；“泰山学者”建设工程专项经费项目；鲁东大学食(药)用真菌创新团队项目

姚强(1979—)，男，助理研究员，博士，主要从事分子育种、微生物生理生化研究。E-mail：qyaomail@163.com

*通信作者：高兴喜(1972—)，男，副教授，博士，主要从事高等真菌分子生物学与代谢生理研究。E-mail：gaoxingxi@yahoo.com.cn