玉米浆调节乳酸发酵基质氧化还原电位参数的研究

张 勇，田 原，丛 威*

(1.中国科学院过程工程研究所，北京 100190；2.中国科学院研究生院，北京 100190；3.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

玉米浆调节乳酸发酵基质氧化还原电位参数的研究

张 勇1,2，田 原3，丛 威1,*

(1.中国科学院过程工程研究所，北京 100190；2.中国科学院研究生院，北京 100190；3.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

乳酸厌氧发酵过程中缺乏有效的监控参数，难以了解菌体在发酵过程中生理状态的变化情况。氧化还原电位(oxidoreduction potential，ORP)对乳酸发酵有直接的影响，能灵敏地反映发酵体系状态的变化。以ORP的变化规律为依据，考察玉米浆的添加量和添加时间对乳酸发酵的影响。结果表明，最佳玉米浆添加量为体积分数0.5%，最适添加时间为30h，即ORP开始回升时。玉米浆的添加有效调节了发酵后期的碳氮比，并维持了有利于乳酸合成的还原性环境，乳酸产量提高了20%。结果显示，ORP可以作为乳酸代谢的调控参数，而玉米浆可以调节发酵醪的ORP。

乳酸；pH值反馈补料；氧化还原电位；玉米浆

乳酸又名2-羟基丙酸，是世界公认的三大有机酸之一，在食品保存、制药、皮革及纺织行业都有广泛的应用[1-3]。发酵法生产乳酸可以采用根霉好氧发酵，也可以采用细菌厌氧发酵[4]。但目前对细菌厌氧发酵乳酸过程缺乏有效的监控参数。

近年来，氧化还原电位(ORP)在厌氧发酵中的应用研究越来越多。Sridhar等[5-6]的研究表明，菌体所处的微观环境对菌体的生长和菌体的代谢流量具有显著的影响，每一株菌株都有一个合适的氧化还原电位。Riondet等[7-8]用氧化还原电位表征菌体生长的微观环境，并通过通入氮气、氢气及添加NaHB4研究氧化还原电位对菌体的影响。黄志华等[9]利用氧化还原电位调控基因工程菌生产1,3-丙二醇。郑继岱等[10]研究了氧化还原电位对乳酸发酵过程的影响机理，并通过向发酵罐中脉冲通气将发酵体系的氧化还原电位控制在合适的范围内以提高乳酸产量。

向体系中添加化学试剂可能对菌体产生一定的毒害作用[11]，而通入氮气、氢气控制氧化还原电位会大量增加生产成本[12-13]，不利于工业放大生产。本实验以氧化还原电位为监控参数，考察其与乳酸发酵体系中各参数间的联系，并以此为依据添加适量的玉米浆以调节乳酸发酵体系的碳氮比和氧化还原电位，从而提高乳酸产量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

乳酸菌(Lactobacillus lactis-11)由山东大学微生物实验室提供。

蛋白胨、酵母粉 英国Oxoid公司；乳酸锂标准品 德国Merck公司；其他试剂为国产化学纯。

液体种子和发酵培养基都为MRS培养基，斜面培养基：MRS中添加2%的琼脂粉。MRS培养基参照文献[14]配制。

1.2 仪器与设备

5L发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；SBA-40生物传感分析仪 山东生物科学研究院；723N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；HPLC-1200高效液相色谱-1200系统 美国Agilent公司；摇床上海国强生化工程装备有限公司；DELTA 320 pH计 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵条件

菌种从斜面转入装有液体种子培养基的摇瓶中，42℃、50r/min培养12h，体积分数10%的接种量转入5L发酵罐中，发酵过程中不通入空气，发酵温度为42℃，pH 6.0，转速100r/min保持发酵液混合均匀，每4h取样一次，稀释20倍测定OD620nm，8000r/min离心10min取上清液测定乳酸质量浓度。

1.3.2 pH值反馈控制补料分批发酵

pH值反馈控制发酵本实验室已有报道[15-16]。发酵液初始糖质量浓度为10g/L，用6mol/L的氨水调节pH值，当葡萄糖质量浓度降到5g/L时，开始采用pH值反馈方法补料，补料液由葡萄糖和氨水混合组成，其质量浓度分别为389g/L和69g/L，葡萄糖与NH3气质量比为5.7:1，发酵结束前4h，改用6mol/L的氨水控制pH值至发酵结束。

1.4 玉米浆调控实验

分别考察玉米浆的添加量和添加时间对乳酸发酵的影响。首先，在ORP值开始回升时添加不同量的玉米浆，添加量分别为体积分数0.2%、0.5%、1%、1.5%，确定玉米浆的最适添加量；然后，分别考察在0、20、30h添加最适量的玉米浆时对乳酸发酵的影响，确定最适添加时间。

1.5 指标测定

1.5.1 葡萄糖质量浓度测定

采用SBA-40生物传感分析仪测定。测定前，发酵液样品先经8000r/min离心10min，取上清液并适当稀释，待酶膜测定仪定标完成后，用进样针吸取25μL进样，测得的数值乘以稀释倍数即为发酵液中葡萄糖质量浓度。

1.5.2 乳酸质量浓度测定

参照文献[17]采用HPLC法测定。

1.5.3 菌体密度测定

利用分光光度计于波长620nm处测定发酵基质的吸光度，然后转换成菌体干质量[15]。

1.5.4 氧化还原电位测定

采用Mettler Toledo氧化还原电极测定[10]。

2 结果与分析

2.1 不同初始糖质量浓度条件下乳酸发酵过程中各参数的变化趋势

为了解乳酸发酵过程中ORP的变化规律以及与其他参数间的联系，分别考察不同初始糖质量浓度条件下，采用pH值反馈补料方式的分批补料发酵中ORP与其他参数间的关系。

图1 不同初始糖质量浓度条件下乳酸发酵过程中各参数的变化趋势Fig.1 Changes in several parameters during lactic acid fermentation process with various initial glucose concentrations

由图 1 可知，不同初始糖质量浓度条件下，利用pH值反馈控制补糖的方法能将乳酸发酵过程中的残糖质量浓度维持在 5g/L左右，稳定的残糖质量浓度消除了因底物浓度波动较大引起的其他参数的变化，可以更真实的考察ORP值与其他参数间的变化规律。在发酵的前10h，OR P 值急剧下降，随后逐渐进入平稳期，稳定在－ 390mV左右，30h后，ORP值开始回升。发酵开始后，乳酸产率和菌体干质量浓度迅速增加，30h 后，随着ORP值的回升，菌体干质量浓度逐渐趋于平稳，而乳酸产率则迅速下降。这可能是多个因素造成的：1)随着发酵的进行，乳酸质量浓度增加，菌体生长和产酸都受到抑制；2)随着ORP值的回升，导致细胞生理状态发生改变，特别是辅酶因子NADH/NAD+的比值减小，不利于乳酸生产[18]；3)在发酵中后期，由于碳源一直维持在稳定的水平，但氮源因为菌体生长不断减少，造成碳氮比失衡。因此在发酵中后期，根据ORP值的变化情况，补加一定量的氮源可能会有利于维持稳定的ORP环境和菌体的生理状态，从而提高乳酸产量。

2.2 玉米浆添加量对乳酸发酵的影响

玉米浆营养丰富，价格低廉，是发酵工业上常用的有机氮源，以ORP值作为反馈信号，在发酵过程中补加适量的玉米浆，以达到提高乳酸产量的目的。

图2 添加不同量的玉米浆条件下乳酸发酵过程中菌体产率和乳酸产率以及ORP的比较Fig.2 Comparison of cell growth rate (A), lactic acid productivity (B)and ORP (C) during lactic acid fermentation process at the condition of corn syrup with various addition amounts

由图2可见，如果不添加玉米浆，30h以后，ORP开始有明显回升，菌体增长速率为负值，即生物量出现下降，另外乳酸合成速率持续减小；而添加玉米浆后，ORP则回升不明显，生物量基本维持稳定，乳酸合成速率下降放缓，进入一个平台期(除添加0.2%的玉米浆以外)。

表1 不同玉米浆添加量下乳酸发酵过程中各参数对比Table 1 Comparison of several parameters during lactic acid fermentation process with various amounts of corn syrup addition

由表1可见，随着玉米浆添加量的增加，对生物量影响不大，而最大乳酸质量浓度却随之增加，但当玉米浆的添加量大于0.5%时，对进一步提高乳酸产量的作用不显著。因此，综合考虑添加成本和效果，以质量分数0.5%为最适的玉米浆添加量。

从表1还可看出，与不添加玉米浆的情况相比，添加0.2%的玉米浆后，葡萄糖的转化率反而降低了，而生物量变化较小，这说明乳酸菌的代谢流发生了改变，但之后葡萄糖的转化率随玉米浆添加量的增加而增加，这可能是由于玉米浆的添加，一方面调节了碳氮比，另一方面改变了ORP值，维持还原性环境有利于乳酸合成，从而在一定程度上抵消了乳酸菌在更高乳酸环境中受到的抑制作用，提高了葡萄糖的转化率。

从ORP值的变化趋势看，ORP值虽然反映的是体系的氧化还原物质的浓度，但这些物质浓度会对菌体的生理状态及细胞内的代谢流产生影响[10]，因此将ORP值作为乳酸发酵体系的反馈信号，能够迅速反映出菌体产酸能力的变化。

2.3 玉米浆添加时间对乳酸发酵的影响

图3 不同时间添加0.5%玉米浆条件下乳酸发酵过程中菌体产率和乳酸产率以及ORP的比较Fig.3 Comparison of cell growth rate (A), lactic acid productivity (B)and ORP (C) during lactic acid fermentation process with corn syrup addition at 0.5%

为了确定添加玉米浆的最佳时间，在乳酸发酵过程中ORP值变化较明显的几个时间点添加体积分数0.5%玉米浆，考察其对乳酸发酵的影响。

由图3可见，在发酵30h之内，于0h添加玉米浆能提高菌体产率，30h之后，3个时间点添加玉米浆的情况基本趋于相同；乳酸产率方面，0h添加玉米浆条件下，20h乳酸产率开始急剧下降；20h添加玉米浆后，乳酸产率到32h才开始下降；而于30h添加玉米浆后，32～45h乳酸产率进入平台期，延缓了乳酸产率的下降；ORP方面，0h添加玉米浆时，发酵后期ORP有明显回升，而在20h和30h添加玉米浆时ORP回升相对较小，这表明在中后期添加玉米浆能更好地维持还原性ORP环境。

表2 不同时间添加0.5%的玉米浆条件下乳酸发酵过程中各参数对比Table 2 Comparison of several parameters during lactic acid fermentation process when 0.5% corn syrup was added at various time points

由表2可知，在0h和20h添加玉米浆，生物量增加了，但乳酸质量浓度却低于在30h添加玉米浆的情况，相比于不添加玉米浆时的乳酸产量96.3g/L，30h添加玉米浆条件下乳酸产量提高了近20%。此外，在0h添加玉米浆后，后期ORP值仍然回升较明显，说明在发酵前期增加氮源有利于菌体生长，但随着菌体生长的消耗，在后期不能维持适合乳酸菌产酸的还原性环境，使得乳酸产量和葡萄糖的转化率下降。因此，认为在30h ORP开始回升的时候添加0.5%的玉米浆有利于乳酸合成。这也再次证明以ORP为反馈信号调控乳酸发酵过程的可行性和优势所在。

3 结 论

乳酸厌氧发酵体系中ORP与菌体生长及乳酸产率间存在密切联系，ORP值的变化能迅速地反映出乳酸菌的生理状态和产酸能力的变化。本实验结果表明，以ORP为乳酸厌氧发酵的监控参数，在30h ORP回升时添加0.5%的玉米浆，与不添加玉米浆的情况相比，乳酸产量提高了20%。但利用ORP调控乳酸发酵过程的其他参数还需要做进一步的研究。

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Oxidoreduction Potential in Lactic Acid Fermentation Matrix as Regulated by Adding Corn Syrup

ZHANG Yong1,2，TIAN Yuan3，CONG Wei1,*
(1. Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China；2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China；3. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Due to the lack of effective monitoring parameters for anaerobic lactic acid fermentation process, it is difficult to observe the change in physiological status of lactic acid bacteria during the fermentation process. Oxidoreduction potential(ORP) can reflect the status change of anaerobic lactic acid fermentation system. In this study, the optimal addition concentration and time of corn syrup were explored through the evaluation of ORP change. Results indicated that the optimal addition concentration and time of corn syrup were 0.5% and 30 h, respectively. The addition of corn syrup could effectively regulate carbon-nitrogen ratio during the late stage of fermentation and maintain a beneficial reducing environment for lactic acid synthesis,which resulted in a 20% enhancement of lactic acid production. Therefore, ORP can be a monitoring parameter of lactic acid fermentation process, and corn syrup can modulate the ORP during fermentation process.

lactic acid；pH feedback feeding；oxidoreduction potential (ORP)；corn syrup

TQ921.3

A

1002-6630(2011)05-0202-05

2010-05-18

国家“863”计划项目(2007AA10Z360)

张勇(1981—)，男，博士研究生，主要从事有机酸发酵研究。E-mail：zhy0033217@gmail.com

*通信作者：丛威(1969—)，男，研究员，博士，主要从事清洁生产、微生物发酵、生物冶金研究。E-mail：weicong@home.ipe.ac.cn