旁路移植静脉段血管壁再狭窄的形态学研究

李胜,王圣刚,戈小虎

(1石河子大学医学院,石河子832002;2新疆维吾尔自治区人民医院,乌鲁木齐 830001)

旁路移植静脉段血管壁再狭窄的形态学研究

李胜1,王圣刚1,戈小虎2

(1石河子大学医学院,石河子832002;2新疆维吾尔自治区人民医院,乌鲁木齐 830001)

观察自体静脉旁路移植后移植静脉段的血管壁的变化。新西兰大白兔18只,取右侧颈外静脉旁路移植至同侧颈总动脉为实验组,仅游离左侧颈外静脉为假实验组,正常左侧颈外静脉为正常对照组,术后6周取材光镜下观察、测量、比较各血管段内膜、中膜变化差异,电镜观察细胞形态变化。游离的静脉与正常静脉相比无明显变化(P

＞0.05);移植静脉段内膜明显增厚(P＜0.01)。由此可知,自体静脉旁路移植术后内膜明显增厚,并与移植损伤和局部血流动力学改变密切相关。

自体静脉;旁路移植;再狭窄

自体静脉旁路移植术是目前医学界普遍采用的治疗缺血性疾病、改善血液供应的重要手段和基本方法,是血管外科最常见的术式之一。然而,由于移植损伤、静脉与动脉的组织结构、血流动力学差异,自体静脉移植术后的通畅率仍不容乐观。

现有研究表明,下肢静脉旁路移植术后1年内40%的移植静脉发生狭窄或闭塞,冠脉搭桥术后1年内移植静脉的狭窄率高达75%以上[1]。移植血管病变的高发生率严重影响手术的远期疗效,从而引发广大学者对其的研究,既往的研究以“间置移植”模型为主,往往不能如实反映临床以“旁路移植(搭桥)”为主的实际情况。

本实验将通过建立兔自体静脉旁路移植动物模型,来研究术后早中期移植静脉段血管壁的变化,以及可能参与的发病因素。

1 材料与方法

1.1 动物来源与分组

动物来源:新西兰大白兔18只(新疆实验动物研究中心,实验动物使用许可证号:SYXK(新)2003-0003),雄雌各9只,年龄 16～18周,体重 2.5±0.5 kg。

实验分组:右侧颈外静脉旁路移植至同侧颈总动脉为实验组(共18只);仅游离左侧颈外静脉为假实验组(9只);正常左侧颈外静脉为正常对照组(9只)。

1.2 模型建立

术前8h禁食水,称重,以3%戊巴比妥钠行耳缘静脉注射麻醉(用量30 mg/kg,总量2/3静推,1/3缓慢注射,以后根据兔角膜反射用戊巴比妥钠腹腔注射维持麻醉状态。

实验组:显露游离右侧颈外静脉,长约2.0～2.5 cm,彻底清除静脉两端外膜。沿肌间隙入气管旁沟寻及右侧颈总动脉及迷走神经主干,游离颈总动脉,清除前壁外膜,长度约2.5 cm。斜行(角度约30°～45°)切断颈外静脉远端,以肝素盐水20 mL从断端缓慢注入颈外静脉、颈总静脉,使全血肝素化,静脉夹斜行夹闭近端颈外静脉。在颈总动脉近端吻合口附近两端上动脉夹,用显微剪刀纵行剪开近端吻合口(长度约为颈总动脉直径的1.5倍,2.0～2.5 mm),将颈外静脉远端用9-0无损伤线采用二点褥式固定连续缝合法吻合近端吻合口。同法剪断颈外静脉近端吻合至颈总动脉远端吻合口。于第二吻合口缝线打结前开放近心端动脉夹,放血排气后打结,并检查吻合口有无漏血,漏血处补缝1～2针,渗血处按压3 min即可,于二吻合口之间结扎颈总动脉。游离左侧颈外静脉为假实验组;取正常左侧颈外静脉为正常对照组。

1.3 饲养与管理

术后7d,每天给予20 mL肝素盐水腹腔注射防止早期血栓形成,常规饲料饲养。

1.4 标本采集

术后6周获取标本。麻醉方法同上,切开颈部皮肤后,观察移植静脉充盈状况,阻断移植静脉的两端血流,自颈总动脉穿刺向移植静脉管腔内先后灌注肝素生理盐水和4%多聚甲醛固定液对血管进行原位固定(使其直径维持在取标本前水平),取下移植静脉段置于预冷的2.5%戊二醛内,以备光、电镜制样。同时取左侧颈外静脉作为对照。

1.5 光镜标本制备

标本用10%甲醛固定后,取近、中、远段移植静脉各0.4 mm,分别石蜡包埋、切片(4μm),所有切片均行HE染色及弹力纤维染色。HE染色观察血管壁三层结构的变化。弹力纤维染色(EVG法,珠海贝索生物技术有限公司,许可证号20010407):弹力纤维染蓝黑色,胶原纤维呈红色,肌纤维、红细胞呈黄色。

光镜观察形态学变化,采用“杰软病理图像分析系统”进行图像分析。测量内膜、中膜厚度、内弹力周径(C)、新生内膜面积(S),计算内弹力膜围绕面积(S=C2/4π)及管腔狭窄程度(新生内膜面积/内弹力膜围绕面积×100%)。

1.6 透射电镜标本制备

标本用2.5%戊二醛前固定,1%锇酸后固定,梯度酒精脱水,Epon812包埋,超薄切片,铀、铅双重染色,Hitachi-600电镜观察拍照。观察血管3层结构及内皮细胞、平滑肌细胞超微结构改变。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

成功吻合新西兰大白兔右侧颈外静脉-颈总动脉旁路移植18只,吻合成功后,移植静脉段明显扩张,近端吻合口靠移植静脉外侧可见明显涡流形成。术后6周取材:3只(1雌2雄)移植静脉闭塞,余15只(雄7雌8)移植静脉通畅,进入结果分析。通畅移植静脉周围粘连明显,游离时渗血明显,移植静脉段明显膨胀,触之血管壁明显增厚,弹性差。而移植闭塞静脉明显变细,镜下可见吻合口血栓形成,闭塞静脉管腔内大量巨噬细胞聚集。

2.2 光镜下血管壁的病理改变

弹力纤维染色结果(图1、图2)显示:移植静脉段内膜明显增厚,内可见大量胶原纤维及少量弹力纤维。静脉内膜、中膜分界清晰,中膜、外膜分界不清。

移植静脉段内膜厚度及管腔狭窄程度比较结果(表1)表明:移植静脉近、中、远3段内膜均明显增厚,与正常静脉相比差异有统计学意义(F=6.815,P＜0.01),内膜增厚以移植静脉近段外侧增厚最为显著,三段新生内膜面积差异无统计学意义(F=0.792,P＞0.05)。游离的左侧静脉与正常静脉相比差异无统计学意义(T=0.717,P＞0.05)。

HE染色结果(图3)显示:血管3层结构分界不清楚,高倍镜下隐约可见内弹力膜,结合弹力纤维染色分层定位,可见新生内膜由大量的胞外基质、血管平滑肌细胞构成,偶可见巨噬细胞、泡沫细胞和淋巴细胞。中层平滑肌细胞明显增多,细胞排列紊乱。外膜可见丰富的微小血管形成。2例(1雌1雄)移植静脉段有附壁血栓形成,但吻合口未见明显血栓。

图1 正常静脉 (弹力纤维染色 ×10)Fig.1 Normal vein(EVG×10)

图2 移植静脉(弹力纤维染色 ×10)Fig.2 Grafted vein(EVG×10)

图3 移植静脉 (HE染色 ×40)Fig.3 Grafted vein(HE×40)

表1 移植静脉段内膜厚度及管腔狭窄程度比较 n=15Tab.1 Comparison of the intima thickness and the extent of stenosis in normal,dissociated and grafted vein n=15

2.3 透射电镜下细胞改变

透射电镜下细胞改变的照片见图4。

图4 移植静脉 (电镜 ×8000)Fig.4 Grafted vein(EM×8000)

由图4可见:正常颈外静脉内膜由内皮和薄层的内皮下组织构成,内皮细胞呈细长的梭形,排列较紧密,未见微绒毛,细胞外基质较少;中膜由2～3层平滑肌细胞构成,呈收缩(静止)型,长条形,细胞核细长,含有丰富的肌丝和致密体,不含粗面内质网。移植静脉段内皮细胞呈类圆形或多边形凸向管腔,表面有少量细长的胞浆突起,细胞核大不规则,粗面内质网发育,核蛋白体及线粒体较多,细胞外基质丰富,内膜中可见大量合成(分泌)型平滑肌细胞;平滑肌细胞以合成(分泌)型为主,胞体显著增大,表面有不规则胞浆突起,胞浆内肌丝和致密体明显减少,充满了大量平行排列的粗面内质网,核糖体和线粒体等与分泌有关的细胞器,胞核内染色质聚集,核仁明显增大,细胞间纵横交错的胶原纤维明显增多。

3 讨论

移植术后再狭窄的形成是一个多因素参与的极其复杂的病理生理过程[2],包括早期血栓形成、中期内膜过度增生和晚期血管粥样硬化3个独立而又相互关联的重要环节[3]。静脉移植的失败的主要病理生理学改变为急性血管损伤、静脉移植到动脉环境后对变化的血流动力学所做出的适应性反应,以及二者之间的相互作用[4]。移植损伤和术后血流动力学改变被认为是导致血管重构与再狭窄的关键环节[5]。它们主要通过调节基因、细胞因子的表达以及炎症反应,从而最终导致血管再狭窄的发生。

移植损伤包括机械损伤和缺血再灌注损伤,主要参与早期内皮细胞的损害和血栓的形成。术中解剖、游离、结扎、暴牵拉等机械操作均可造成血管壁的直接损伤,而广泛的游离和显露致使血管壁营养血管以及血管周围自主神经严重损伤,从而中断其神经支配和营养来源,经历缺血损伤[6];术后随着血流的恢复及营养血管的再生,血管壁组织细胞将再次遭受再灌注的打击。血管内皮细胞(VEC)损伤后可引起多种黏附分子、炎症因子和免疫介质表达紊乱,增加血小板和VEC、白细胞间的黏附,并通过细胞或体液途径激活补体和凝血、纤溶系统,促进血小板和凝血系统激活。同时,血管壁损伤减弱VEC合成和分泌抗血栓物质的作用,从而诱发大规模的血小板聚集和血栓形成,导致移植术后发生血管闭塞[7]。研究表明,术后4周 VEC层才能完全修复,而术后1周是VEC损伤最严重的时期,也是早期血栓形成高发时期[8]。本实验中,尽管术后1周给予肝素盐水20mL/d腹腔注射,仍有3例出现吻合口血栓形成最终致移植失败,考虑主要由于移植损伤及吻合口狭窄所致,因此在仔细手术操作的同时应加强术后抗凝治疗。

VEC损伤是血管内膜过度增生发生发展的基础,而持续复杂的血流动力学改变是导致血管最终狭窄的决定性因素。由于静脉与动脉在组织结构与血液动力学方面的差异,静脉移植到动脉环境后立即出现局部扩张、血流动力学改变,甚至局部低剪切力及涡流形成。在持续复杂的血流动力学作用下,VEC表达血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、一氧化氮合酶、基质金属蛋白酶等大量平滑肌细胞(SMC)有丝分裂原,同时增加内皮素-1和血管紧张素-Ⅱ的释放,从而促进SMC由收缩型转变为合成型,并不断增殖、活化、迁移,并释放大量细胞外基质(ECM)[9],引起内膜的显著增厚。另外,在持续低剪切力的作用下,血液成分沿血管壁停留时间延长,从而上调凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体[10]。VEC代谢紊乱,也可激活生物合成酶,增加VEC过氧化阴离子含量,使被氧化修饰的脂质在内皮下大量聚集,增殖迁移到内膜的SMC在吞噬脂质后形成平滑肌源性泡沫细胞。另外,在动脉高压力环境下,移植静脉内膜完整性的破坏导致局部炎症反应,单核细胞大量黏附于VEC并转入内皮下,吞噬被氧化修饰的脂质形成单核细胞源性泡沫细胞。并进一步增多、融合,最终形成粥样斑块[11]。本实验中,术后6周可见移植静脉段内膜明显增厚,内膜下可见大量增生的ECM、血管SMC,偶可见巨噬细胞、泡沫细胞和淋巴细胞,电镜下可见大量合成型SMC,实验结果与既往研究相一致。另外,本实验中发现血管各部位内膜增厚程度并不完全一致,与局部血流缓慢、涡流形成密切相关。移植静脉近端吻合口外侧为低剪切力、涡流形成区域,此处内膜增厚最为明显[12]。

综上所述,本研究结果显示自体静脉旁路移植术后移植静脉段内膜明显增厚,并与移植损伤和局部血流动力学改变密切相关。

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Restenosis after Autos Vein-To-Artery Grafted Bypass

LI Sheng1,WANG Shenggang1,GE Xiaohu2
(1 Medical College,Shihezi University,Shihezi 832002,China;2 People’s Hospital of Xinjiang,Urumqi 830001,China)

To observe the restenosis after the vein-to-artery grafted bypass.18 New Zealand Rabbits were endured the experiment.To transplant the right external-jugular-vein to the right arteria-carotis-communis bypass as the experiment group;To dissociate the left external-jugular-vein as the provided experiment group;And to choose the normal wein as the compared group.6 weeks after the operation,kill the rabbits and get the specimen.To observe,measure and compare the different change of the vessels by light microscope,and observe the Morphologic change of the VECs and the SMCs by electron microscope.The change of the dissociated vessels are similar to the normal veins(P＞0.05);The endomembranes of the grafted veins are much more thicker than the normal veins’(P ＜ 0.01).After the vein-to-artery transplanting operation bypass,the grafted veins’intima are thickened remarkably,And the location of he thickened intima are extremely related with the changed hemodynamics.

autos vein-to-artery grafted;bypass;restenosis

R654.4 < class="emphasis_bold">文献标识码:A

A

2010-03-20

李胜(1982-),男,硕士生,专业方向为血管外科学。

戈小虎(1962-),男,教授,从事血管外科学研究;e-mail:gexiaohu136@163.com。