硫酸酯化丝素的最佳反应条件研究

张世才，欧 洪，蓝广芊

(西南大学 纺织服装学院，重庆 400716)

硫酸酯化丝素的最佳反应条件研究

张世才，欧 洪，蓝广芊

(西南大学 纺织服装学院，重庆 400716)

采用浓硫酸-正丁醇法对丝素进行硫酸酯化，将硫酸基团接枝到丝素蛋白上。以硫酸酯化丝素质量和酯化丝素中硫酸基质量分数作为考察指标，采用L16(43)正交试验，探讨反应温度、反应时间、硫酸质量分数对硫酸酯化丝素产量和产物中硫酸基质量分数的影响。结果表明，各因素对硫酸酯化丝素的产量影响大小顺序是：温度＞时间＞硫酸质量分数，各因素对硫酸酯化丝素的硫酸基质量分数影响大小顺序是：硫酸质量分数＞时间＞温度；经进一步单因素实验，结果表明硫酸酯化丝素的反应最优化条件是硫酸质量分数为95 %，反应温度为0 ℃，反应时间为4 h。

丝素；硫酸酯化；正交实验

心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是影响50岁以上中老年人健康的常见病，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍有50 %以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理。全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1 500万人，居各种死因首位，心脑血管疾病已成为人类死亡的头号杀。手而抗凝血药物在心脑血管的治疗及人工器官安装手术中具有极为重要的作用。

目前，肝素或肝素钠是外科预防血栓形成及妊娠者抗凝治疗的常用药，然而肝素或肝素钠的副作用大，成本较高，且容易造成生物污染，因此，科研工作者一直在寻找具有良好的生物相容性且高效抗凝血的新材料。据研究，肝素的抗凝血功能与其本身带有的硫酸基团的数量密切相关[1]，并且实验证明许多天然多糖被接枝硫酸基后均表现了较好的抗凝血作用[2-5]。本研究尝试运用化学接枝的方法，探索在丝素蛋白上接枝硫酸基的最佳实验条件，为具有抗凝血作用的丝素产品多用途开发，推动蚕丝蛋白的多功能利用开辟了新的途径。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：蚕茧(北碚蚕种场)，透析袋(西格玛公司)，抗凝血酶试剂盒(西格玛公司)，肝素钠(西格玛公司)，浓硫酸、正丁醇、硫酸铵、氢氧化钠、氯化钡、明胶、盐酸、pH试纸、无水乙醇、枸櫞酸钠(成都市科龙化工试剂厂)。

仪器：TDL-4A型低速台式离心机(菲恰尔公司)，TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器责任有限公司)，超低温冰箱，普通冰箱，D40-2F电动搅拌机(杭州仪表电机有限公司)，JA2003A电子天平(上海精天电子仪器有限公司)，恒温水浴锅(成都比朗实验设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 丝素的溶解与提纯

将剥去茧衣的蚕茧用剪刀剪成4块并烘干后投入浴比1∶100的0.5 % Na2C03溶液中煮沸，脱胶30 min，用自来水冲洗，重复操作1次。将经过2次脱胶后的茧丝用蒸馏水洗净，置于80 ℃烘箱内烘干。用配制好的苦味酸胭脂红溶液法检验并确认丝胶已脱净，将得到的纯净丝素用蒸馏水洗涤干燥备用。

丝素溶解工艺[6-7]为温度80 ℃、时间4 h、浴比1∶10，将溶解后的丝素溶液冷却后灌入透析袋中，在流动的自来水中透析72 h。然后用蒸馏水多次透析，除去丝素溶液中的Ca2+、Cl-等离子及分子量过低的丝素蛋白分子，截留相对分子质量在10 000以上的丝素蛋白分子。透析后的丝素溶液在80 ℃下浓缩，直至完全干燥，研磨成粉末，过400目筛，保存。

1.2.2 丝素的硫酸酯化

硫酸酯化方法主要包括三氧化硫法、浓硫酸法、氯磺酸法、二氧化硫和氧气法及亚硫酸盐法等[8-9]。本研究选取正丁醇作为溶剂，采用浓硫酸-正丁醇法对丝素进行硫酸酯化。取配制好的浓硫酸75 mL与25 mL含有12.5 g硫酸铵的正丁醇溶液混合，搅拌后冰水浴中冷却至0 ℃，在磁力搅拌下缓慢放入10 g丝素粉末，反应一定时间，结束后，用已冷却至0 ℃的4 mol/L NaOH溶液中和至pH为7.5，所得溶液以40 000 r/min离心10 min，去沉淀；上清液加过量无水乙醇充分沉淀30 min，溶液继续以40 000 r/min离心10 min，收集沉淀，加蒸馏水溶解，装入透析袋(相对分子质量为3 500道尔顿)，自来水透析3 d，换蒸馏水继续透析2 d，所得溶液在60 ℃恒温浓缩直至固体产物完全干燥，搜集将其放入冰箱内冷藏备用。

1.2.3 丝素的硫酸酯化条件正交实验设计

由于影响酯化的条件主要有酯化时间、酯化温度，而其对结果的影响非常明显，为了便于考察，不使实验次数太多，选取影响结果的3个主要因素：硫酸质量分数、反应温度、反应时间为考察对象，每个因素拟采取4个水平，选用L16(43)正交表进行正交试验，以硫酸基的质量分数及产物质量作为考察指标，正交因素水平见表1。

表1 因素水平Tab.1 Level οf factοr

1.2.4 硫酸基质量分数的测定

准确而又可靠地分析测定硫酸酯化丝素的产物中硫酸基的质量分数很重要，到目前为止，尚没有一个统一、规范的测定方法，如灰分法、盐酸水解-硫酸钡重量法[10]、硫酸钡浊度法[10]、联苯胺法[11]等，实验选用盐酸水解-硫酸钡质量法[12]进行产物硫酸基质量分数测定。

2 结果与讨论

2.1 正交实验结果

产物质量正交实验结果见表2。

表2 产物质量正交实验结果Tab.2 Orthοgοnal analysis fοr the prοduct weight

1)从表2中可以看到，产物质量最高的是11号实验(A3B1C3)，接枝产物质量为2.43 g，极差分析显示5.47＞5.09＞4.50，即各因素对产物质量的影响程度为：反应温度C＞反应时间A＞硫酸质量分数B；要得到较多的产物，由实验结果可知最佳条件为A3B1C3，即条件为：反应时间4 h、硫酸质量分数为95 %、反应温度为－5 ℃时，可制得最多产物。

2）从表2中可以看到，16号实验(A4B1C4)的硫酸基质量分数为25.65 %，极差分析显示69.20 %＞64.70 %＞49.40 %，即各因素影响结果程度为：硫酸质量分数B＞反应时间A＞反应温度C，可知最佳浓硫酸质量分数为95 %，最佳时间为2 h，最佳温度为0 ℃，故在实验条件为A1B1C4时，产物中硫酸根所占的比例最大。

由于硫酸酯化产物最高反应条件和硫酸基质量分数最高条件不一致，为既能得到较多硫酸酯化产物，又能使产物中硫酸基质量分数较高，在正交试验结果的基础上又进行了单因素实验，探讨硫酸质量分数、反应时间、反应温度各自对硫酸酯化丝素的影响，从而得到硫酸酯化丝素的最佳条件。

2.2 反应温度对硫酸酯化丝素的影响

为确定反应温度对硫酸酯化丝素的影响，设定硫酸质量分数为95 %，逐步变化反应温度，由于在正交实验结果中，反应2 h和4 h都对产物有影响，为了更好地确定与反应时间的关系，同时做了4 h和2 h的2组实验，并测定硫酸酯化丝素质量和硫酸基质量分数；设定反应温度分别为：5，0，－5，－10，－15 ℃，其他条件不变，具体实验结果见图1。

从图1可以看出，在4 h和2 h的反应体系中，硫酸酯化丝素的质量和硫酸基质量分数的变化趋势基本相同，都是在0 ℃时硫酸酯化丝素的质量和硫酸基质量分数达到最高，其中，质量随着温度的升高而逐步升高，而硫酸基质量分数随温度的变化起伏不大，但是，在5 ℃时，两者均突然降到很低的水平，主要是因为该反应会放出大量的热，在5 ℃时，大部分丝素还来不及反应就被焦化，从而造成硫酸酯化丝素的质量和质量分数均很低，因此，认为0 ℃是最佳反应温度。同时，在图1中还可以看到，在反应时间为4 h的实验数据中，硫酸酯化丝素的质量更高，而与反应时间为2 h的结果相比，硫酸基质量分数相差不大，分析是反应时间长更有利于硫酸酯化丝素的生成，因此在探讨硫酸质量分数对硫酸酯化丝素的影响时决定采用反应时间为4 h，而对于反应时间是否越长越好的问题，将在2.4中进行探讨。

图1 温度对硫酸酯化丝素的影响Fig.1 Effect οf temperatiοn οn the sulfuric acid esterif i catiοn fi brοin

2.3 硫酸质量分数对硫酸酯化丝素的影响

为确定硫酸质量分数对硫酸酯化丝素的影响，设定反应温度为0 ℃，反应时间为4 h，逐步变化硫酸质量分数，测定硫酸酯化丝素质量和硫酸基质量分数；由于硫酸质量分数在75 %时几乎不反应，因此设定硫酸反应质量分数分别为：95 %，90 %，85 %，80 %，其他条件不变，具体实验结果见图2。

图2 硫酸质量分数对硫酸酯化丝素的影响Fig.2 Effect οf cοncenteatiοn οf sulfuric acid οn the sulfuric acid esterif i catiοn fi brοin

从图2可以看到，在反应温度为0 ℃、反应时间为4 h的条件下，硫酸酯化丝素质量和硫酸基质量分数均随着硫酸质量分数的提高而逐步提高，其中在硫酸质量分数95 %时到达最高，说明硫酸质量分数，越大越有利于对丝素进行硫酸酯化；因此可以认为硫酸质量分数为95 %是丝素硫酸酯化的最佳质量分数。

2.4 反应时间对硫酸酯化丝素的影响

为确定反应时间对硫酸酯化丝素的影响，设定反应温度为0 ℃，硫酸质量分数为95 %，逐步变化反应时间，测定硫酸酯化丝素质量和硫酸基质量分数，设定反应时间分别为：1，2，3，4，5 h，其他条件不变，具体实验结果见图3。

图3 反应时间对硫酸酯化丝素的影响Fig.2 Effect οf reactiοn time οn the sulfuric acid esterif i catiοn fi brοin

从图3可以看到，反应温度对硫酸酯化丝素的质量影响比较显著，硫酸酯化丝素的质量随着反应时间的增加而增加，在4 h时到达最大，在5 h时质量略有下降，主要原因分析是硫酸酯化丝素在过量的浓硫酸环境中会被进一步分解为相对分子质量更小的物质，在透析纯化过程中会通过透析袋被损失掉；而反应时间对产物中硫酸基质量分数影响不大，在反应时间2 h时达到最大，其他反应时间波动不大，因此，在为获得硫酸酯化丝素最大质量，同时，硫酸基质量分数也能维持在较高的水平上的前提下，确定最佳反应时间为4 h。

3 结 论

1)从实验的结果中可见，使用浓硫酸对丝素进行硫酸酯化是可行的，能够为生产实践提供一定可靠的依据。同时使用浓硫酸代替氯磺酸对丝素进行酯化不仅可以简化制备条件，而且实验具有更好的可操作性。

2)通过对正交试验结果得知：反应时间为4 h、硫酸质量分数为95 %、反应温度为－5 ℃时，可制得最多产物；反应时间为2 h、硫酸质量分数为95 %、反应温度为0 ℃时，接枝硫酸基的质量分数达到最高。通过单因素实验可知，硫酸酯化丝素的最佳反应条件为硫酸质量分数为95 %，反应温度为0 ℃，反应时间为4 h，经实验验证，该条件下反应所得硫酸酯化丝素质量2.30 g，硫酸基质量分数为24.26 %，并且实验所得到的硫酸酯化丝素易溶于水，经初步实验表明具有较好的抗凝血性能，可为开发新型的抗凝血生物医学材料，推动丝素蛋白的多功能应用研究提供参考。

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Explοring οf the mοst οptimum cοnditiοn creating the sulfated fi brοin

ZHANG Shi-cai, OU Hong, LAN Guang-qian
(Cοllege οf Textile and Garment, Sοuthwest University, Chοngqing 400715, China)

This article uses Sulfuric acid-n-Βutanοl methοd fοr esterificatiοn οf sulfuric acid etc, grafting the sulfuric acid grοups tο the silk fibrοin. Using the quality οf sulfuric acid esterificatiοn silk fibrοin and the cοntent οf sulfate radical in esterificatiοn silk fibrοin as indexes, the οrthοgοnal experiments are adοpted. Reactiοn temperature, reactiοn time and the cοncentratiοn οf sulfuric acid are taken tο be the three factοrs. The experiments results find the sequence affecting the οutput οf esterificatiοn silk sulfuric acid is that: reactiοn temperature ＞time ＞ cοncentratiοn οf sulfuric acid, and the sequence affecting the cοntent οf sulfate radical in esterificatiοn silk fibrοin is: the cοncentratiοn οf sulphuric acid ＞reactiοn time ＞ reactiοn temperature. The single factοr experiment οbtains the synthesis οptimum cοnditiοn is: Temperature:0 ℃,time:4 h, the cοncentratiοn οf sulfuric acid: 95 %.

Fibrοin; Sulfuric acid esterificatiοn; Orthοgοnal experiment

TS149

A

1001-7003(2011)02-0009-04

2010-09-08；

2010-11-19

西南大学基本科研业务费专项资金资助项目(swu208 006)；西南大学国家大学生创新性实验计划项目(091063528)

张世才(1986－ )，男，纺织工程专业，本科生。通讯作者：蓝广芊，讲师，j070218@swu.edu.cn。