丝素/半水硫酸钙/磷酸钙骨水泥复合材料初探

黄阳阳，谢瑞娟,，于法鹏，王 彪，王 鹏

(1.苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215021；2.现代丝绸国家工程实验室，江苏 苏州 215123)

丝素/半水硫酸钙/磷酸钙骨水泥复合材料初探

黄阳阳1，谢瑞娟1,2，于法鹏1，王 彪1，王 鹏1

(1.苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215021；2.现代丝绸国家工程实验室，江苏 苏州 215123)

在半水硫酸钙/磷酸钙骨水泥系统中添加丝素蛋白(SF)和纳米羟基磷灰石(n-HA)以改善其性能，用X-射线衍射和FT-IR光谱研究材料的结构和组分，用扫描电子显微镜观察材料的表面形态，用排液法测定材料的孔隙率，用通用力学试验机测定样品的抗压性能。结果表明，丝素/半水硫酸钙/磷酸钙骨水泥(SF/CSH/CPC)复合材料的固相与液相发生固化反应后，生成了羟基磷灰石，并含有未完全转化的磷酸四钙和无水磷酸氢钙。与纯半水硫酸钙/磷酸钙系统相比，加入SF和n-HA的复合材料的孔隙率增加，其结构和凝固时间无明显差异；添加n-HA，压缩强度有所下降，但压缩断裂功无明显差异；添加SF，虽然压缩强度也有所下降，但压缩断裂功增加明显。

丝素；纳米羟基磷灰石；磷酸四钙；硫酸钙；压缩断裂功

硫酸钙(CS)用作骨修复材料已经有很长的历史，CS具有生物相容性良好、对周围组织不产生炎症和异物刺激作用、在体内能够完全被降解吸收等优点。但CS的降解速度快于新生骨组织的生长速度，这限制了它在临床上的广泛应用[1]。

20世纪80年代，Brown等研制了磷酸钙骨水泥(CPC)，它主要由固相(多种磷酸钙盐的混合物)和液相(蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、血液等)组成。固相粉末和固化液调和后，在室温或体内生理条件下自行固化，最终产物为与骨组织的无机成分极为相似、晶相结构亦与骨组织相近的羟基磷灰石(HA)。CPC具有良好的生物相容性、可降解性、骨传导性，可任意塑型，与周围骨组织连接紧密等多种优点。但是普通CPC存在脆性大、凝固时间长、降解速度较慢等缺点，因而研究者们将CPC与各种材料如壳聚糖、可吸收纤维、胶原等进行复合[2-5]，但均未取得重大突破。

丝素蛋白(SF)不仅具有良好的力学性能，而且还具有良好的生物相容性、可降解性。SF作为生物医用材料的优异性能和巨大潜力引起了国内外生物材料界的极大关注，美国、日本、韩国、意大利等国的多个生物医用材料研究组近年逐渐将研究重点转向蚕丝丝素材料，对丝素材料与细胞的相互作用进行了大量的研究，其应用目标包括软骨、韧带、血管、皮肤、神经、骨组织等的再生[6-7]。谢瑞娟等研究表明SF能改善CPC的力学性能[8]。

关于HA对磷酸四钙体系的凝固时间和抗压强度影响的研究结果有两种观点：一种观点认为添加HA晶种可以大大缩短固化时间，提高抗压强度[9-10]；另一种观点则认为添加HA晶种虽可以加速水化过程，但骨水泥的压缩强度下降[11]。而SF和HA对硫酸钙/磷酸钙体系骨水泥的影响未见有关报道。

本研究CPC选择磷酸四钙(TTCP)和无水磷酸氢钙(DCPA)，CS选具有自固化能力的半水硫酸钙(CSH)，在硫酸钙/磷酸钙系统中添加SF和纳米羟基磷灰石(n-HA)，制备SF/CSH/CPC复合材料，以期改善复合材料的力学性能和孔隙率，探讨SF和n-HA对复合材料性能的影响，为SF、n-HA用于可注射人工骨——硫酸钙/磷酸钙骨水泥复合材料提供参考。

1 材料与方法

1.1 SF的制备

将家蚕丝置于0.05 %无水碳酸钠溶液中，在100 ℃条件下重复处理3次以脱去蚕丝中的丝胶。将脱胶后所得的丝素纤维放入CaCl2、H2O和C2H5OH的三元混合溶剂中，在(72±2)℃条件下搅拌得到棕黄色的丝素-CaCl2混合液。将所得的丝素-CaCl2混合溶液经透析过滤获得丝素溶液。用喷雾干燥设备将该丝素溶液在进风温度为150 ℃下干燥制得无定形为主的丝素蛋白粉，再用乙醇处理该SF粉制得结晶型的SF粉。

1.2 CPC的制备

TTCP的制备：按钙磷摩尔比1.67称取一定量的Ca(NO3)2•4H2O和(NH4)2HPO4分别配制成溶液，将(NH4)2HPO4溶液滴加到Ca(NO3)2•4H2O溶液中，保持溶液的pH值在9～10。滴加完毕后继续搅拌反应3 h，陈化24 h后，按整个系统钙磷摩尔比为2.0的比例向所得悬浮液中同时滴加Ca(NO3)2•4H2O溶液和(NH4)2CO3溶液，滴加完毕后陈化24 h，再进行过滤洗涤，将获得的滤饼放在烘箱中干燥后再放到气氛高温炉中，在1 500 ℃下煅烧8 h后，进氮气冷却至1 300 ℃取出样品在空气中急冷得到TTCP，研磨后过250目标准筛后获得TTCP粉末。

DCPA的制备：取一定量的二水磷酸氢钙(DCPD)在QM-3SP2球磨机中球磨15 h后取出并放入120 ℃烘箱烘12 h，过300目标准筛后获得DCPA粉末。

CPC的制备：将TTCP和DCPA以1∶1的摩尔比混合获得磷酸钙骨水泥固相。

1.3 复合材料的制备

按照一定的液固比向固相中加入固化液，将其调制成膏状体并填注于不锈钢模具(直径6 mm，高度12 mm)中，将此模具置于温度(37±0.5)℃、相对湿度100 %的环境中4 h后脱模取出样品，再将该样品放入温度(37±0.5)℃的模拟体液中20 h，得到复合材料的固化体。本研究选择4种固相，其组成及配比如表1所示。

表1 固相的组成及配比Tab.1 Composition and proportions of solid phase

1.4 复合材料的组分及结构测定

X-射线衍射：使用X-射线多晶衍射仪(荷兰，X’Pert-Pro MPD)，在管电压40 kV，管电流40 mA，扫描速度为5(°)/min，用超能探测器记录2θ＝5°～60°的材料的X-射线衍射强度曲线。

红外光谱：将各复合材料样品的粉末分别与KBr压片制样，用Nicolet 5700 FT-IR红外光谱仪进行测定，扫描范围在4 000～400 cm-1测得各样品红外光谱图。

1.5 复合材料的凝固时间测定

将固相原料与固化液按一定的液固比混合调匀后，填注于直径9 mm、高40 mm的模具中后，放置在温度(37±0.5)℃、相对温度100 %的环境中养护。每隔一定时间取出样品用ISO水泥标准维卡仪测定，若样品的表面有压痕，则将样品继续养护一段时间后再测，直至样品表面不能观察到圆形压痕为止。从骨水泥固液相混合均匀开始至样品表面无圆形压痕的这段时间定为凝固时间。

1.6 复合材料的抗压性能测定

用砂纸轻轻把试样两端打磨平滑，制成规格为6 mm×12 mm的试样，在Instron5566力学万能测试机上测试，以加载速度1 mm/min进行轴向加压，由自动记录仪记录压力和位移的变化，根据所测得的力学指标获得压缩强度、压缩断裂功。

1.7 复合材料的孔隙率测定

利用排液法测定复合材料的孔隙率。先用砂纸打磨样品使表面尽量光滑，将样品在105 ℃烘箱中烘2 h后取出并称样品质量W(g)；将样品浸没在乙醇中，然后放入干燥器中抽真空1 h；把浸泡过的样品放入盛有一定体积V1(mL)乙醇的量筒中，记下放入样品后液面高度V2(mL)后，取出样品称得其质量为W1(g)；根据下式计算样品的孔隙率M(乙醇的密度ρ1＝0.78 g/cm3)：

2 实验结果与分析

2.1 复合材料的X-射线衍射分析

图1为复合材料固相原料的X-射线衍射曲线。由图1可知，样品1、2、3、4固相原料的X-射线衍射曲线在2θ＝25.3°、29.2°、29.8°、32.4°等处均出现了TTCP的特征衍射峰，在2θ＝26.5°、30.2°等处出现了DCPA特征峰，2θ＝14.7°处出现了CSH特征峰，这说明了4种固相原料都含有TTCP、DCPA及CSH。而在2θ＝32.9°处(样品2、4)出现了HA的特征衍射峰，这说明样品2、样品4中还含有HA。

图1 固相原料的X-射线衍射曲线Fig.1 XRD curves of solid phase raw material

图2为复合材料固化体的X-射线衍射曲线。由图2可知，样品1、2、3、4固化体的X-射线衍射曲线在2θ＝31.8°、32.9°等处均出现了HA的特征衍射峰；在2θ＝25.3°、29.2°、29.8°处均出现了TTCP的特征衍射峰，在2θ＝30.2°处均出现了DCPA的特征衍射峰，在2θ＝35.4°、43.5°处均有微弱的二水硫酸钙特征衍射峰。这说明复合材料初始固相与液相发生固化反应后，均产生了新的组分HA，同时还含有少量未完全转化的TTCP和DCPA；CSH在固化反应后转变为二水硫酸钙；SF和HA的加入对复合材料结构无明显影响。

图2 固化体的X-射线衍射曲线Fig.2 XRD curves of solidif i ed body

2.2 复合材料的FT-IR光谱分析

图3为复合材料固相原料的FT-IR光谱图。由图3可知，样品1、2、3、4在565 cm-1、1 067 cm-1附近均出现PO43-的特征吸收峰，在1 135 cm-1附近出现SO42-的特征吸收峰。这说明本研究所用的CPC原料含有磷酸盐和硫酸钙，这与X-射线衍射分析的结果相符。

图4 固化体的FT-IR光谱Fig.4 FT-IR spectra of solidif i ed body

图3 固相原料的FT-IR光谱Fig.3 FT-IR spectra of solid phase raw material

图4为复合材料固化体的FT-IR光谱图。由图4可知，样品1、2、3、4在565 cm-1、603 cm-1、1 034 cm-1、1 067 cm-1附近均存在较强的HA中的PO43-的特征吸收峰[12]，而在1 626 cm-1、3 430 cm-1附近都有OH-的特征吸收峰，说明固相原料与液相发生固化反应生成了HA，这也与X-射线衍射分析的结果相符。加入SF的复合材料的FT-IR光谱图(样品3、4)与不加SF的(样品1、2)相比无明显差异，特征峰的位置也很接近。这也证明SF和HA的加入对复合材料的结构无明显影响，其固化后最终产物中也都出现了HA。

2.3 复合材料的凝固时间

在本实验条件下测得样品1、2、3、4的凝固时间(min)分别为：10.33±0.58，11±1.00，10.33±0.58，11.67±0.58。由此可见，在硫酸钙/磷酸钙系统中单独添加n-HA(样品2)或SF(样品3)或同时添加n-HA、SF(样品4)其凝固时间均无明显差异，均符合Khairoun[13]根据临床试验提出的凝固时间需小于15 min的要求。

2.4 复合材料的SEM观察

图5为复合材料固化体的扫描电镜照片,a～d分别代表样品1～4，a1～d1放大500倍，a2～d2放大2万倍。

图5 固化体的扫描电镜照片Fig.5 SEM images of solidif i ed body

由图5可知，4种复合材料固化体表面均出现了一些微孔(a1、b1、c1、d1)，且在CSH/CPC复合材料中单独添加n-HA(b1)或同时添加n-HA和SF(d1)的孔隙比纯硫酸钙/磷酸钙系统(a1)的孔隙大而深。这说明在本实验条件下，添加n-HA或SF改善了复合材料的孔隙状况。在放大2万倍的SEM照片上均观察到了HA的晶状结晶体(a2、b2、c2、d2)。这也说明CPC在固化过程中成分确实发生了变化，形成了新的成分HA，这与X-射线衍射分析及FT-IR光谱的结果是一致的。

2.5 复合材料的孔隙率

用排液法测得的样品1、2、3、4的孔隙率分别为(42±2)%、(45±1)%、(44.5±3)%、(46±7)%。这说明，在本实验条件下，在硫酸钙/磷酸钙系统中单独添加n-HA(样品2)或SF(样品3)或者同时添加n-HA、SF(样品4)的孔隙率均比纯硫酸钙/磷酸钙系统(样品1)的高，这与SEM观察的孔隙状况相符。这也同时说明添加n-HA或SF或同时添加这两种物质，复合材料的孔隙率均有提高，对细胞生长是有利的。

2.6 复合材料的力学性能

由表2可知，与纯硫酸钙/磷酸钙系统(样品1)相比，在硫酸钙/磷酸钙系统中单独添加n-HA(样品2)，压缩强度有所下降，但压缩断裂功无明显差异；在硫酸钙/磷酸钙系统中添加SF的虽然压缩强度也有所下降，但压缩断裂功增加明显。这说明SF能改善硫酸钙/磷酸钙复合材料的力学性能，增加了材料的韧性。压缩强度下降是由于材料的孔隙率大造成；而加入SF后材料的压缩断裂功增加可能是硫酸钙/磷酸钙系统中释放出来的钙离子与SF上氨基、羧基和羟基形成了一定的结合，当外力作用到材料上，应力通过基体传到丝素大分子，丝素分子发生滑移，使材料应变增加，最终使压缩断裂功增加。

表2 复合材料的力学性能Tab.2 Mechanical properties of the composites

3 结 论

1)由X-射线衍射分析和FT-IR光谱分析可知，SF/CSH/CPC复合材料的固相与液相发生固化反应后，生成了产物HA，同时还含有未完全转化的TTCP、DCPA。SF、n-HA的加入，对材料结构无明显影响。

2)由SEM照片显示，SF/CSH/CPC复合材料的固体化表面出现了大小不一的微孔，且在硫酸钙/磷酸钙系统中单独添加n-HA或同时添加n-HA和SF的孔隙比纯硫酸钙/磷酸钙系统的孔隙大而深；固化反应产物中也均出现了HA晶状体。

3)用排液法测得的孔隙率为：在硫酸钙/磷酸钙系统中单独添加n-HA或SF或同时添加n-HA和SF的大于纯硫酸钙/磷酸钙系统的，即复合材料的孔隙率得到了提高。这将有利于细胞的生长、骨组织缺损的修复。

4)与纯硫酸钙/磷酸钙系统的相比，在硫酸钙/磷酸钙系统中添加n-HA的压缩强度有所下降，但压缩断裂功无明显差异；添加SF的虽然压缩强度也有所下降，但压缩断裂功增加明显，使复合材料的韧性得到了改善。关于丝素蛋白的比例、液固比等对复合材料性能的影响有待进一步研究。

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Preliminary study of silk fi broin/calcium sulfate hemihydrate/calcium phosphate cement composite materials

HUANG Yang-yang1, XIE Rui-juan1,2, YU Fa-peng1, WANG Biao1, WANG Peng1
(1. College of Textile and Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 215021, China; 2. National Engineering Laboratory for Modern Silk,Suzhou 215123, China)

The properties of calcium sulfate hemihydrate(CSH)/calcium phosphate cement(CPC) system had improved by adding silk fibroin (SF) and nano-hydroxyapatite(n-HA). The structure and composition of materials was studied by X-ray diffraction. The surface morphology of materials was observed by scanning electron microscope. The porosity of materials was evaluated by drainage method, and the mechanical property of materials was tested by Instron Universal Testing Machine. The results showed that after the setting reaction of the solid and liquid phase of SF/CSH/CPC composites, HA was produced and tetracalcium phosphate and dicalcium phosphate anhydrous which were not totally transferred was still contained. Compared to pure CSH/CPC system, the porosity of the composites was improved when adding SF and n-HA, and the structure and setting time of them had not significant differences. The compressive strength of the composites was decreased while work-of-compressive had not significant infection when adding n-HA. The compressive strength of the composites had decreased slightly while work-of-compressive of them obviously improved when adding SF.

Silk fibroin; Nano-hydroxyapatite; Tetracalciun phosphate; Calcium sulfate; Compression fracture work

R318.08；TB332

A

1001-7003(2011)04-0012-05

2010-10-20；

2010-12-06

江苏省自然科学基金创新学者攀登项目(BK2008 008)；江苏省高校省级重点实验室开放课题(KJS1014)

黄阳阳(1987－ )，男，硕士研究生，研究方向为丝蛋白生物材料。通讯作者：谢瑞娟，教授，硕导，xieruijuan@suda.edu.cn。