超滤膜组件细菌截留性能测试方法研究

刘士栋，于小焱，于涛

（国家海洋标准计量中心，天津300112）

超滤膜组件细菌截留性能测试方法研究

刘士栋，于小焱，于涛

（国家海洋标准计量中心，天津300112）

本文回顾了国内外在超滤膜细菌截留试验领域的研究成果，对中空纤维超滤膜组件的细菌截留检测进行了实验研究，以期为开展超滤膜组件细菌截留性能评价测试提供实验依据。

超滤膜；细菌截留；检测

因为细菌及其芽孢的大小通常大于0.2μm，所以按照超滤的过滤精度足以截留住几乎所有细菌。但是，超滤膜组件在制造和工程应用的时候容易出现大孔和发生膜丝断裂的情况，从而造成膜组件的完整性受损，从而无法对细菌进行良好的截留。我们在ASTM F838-05以及JISK3823-1990（2006）的基础上进行了探索研究和试验验证以期建立适合我们国家检测机构的超滤膜组件细菌截留性能评价方法。

1 材料与设备

1.1 设备

中空纤维膜组件测试装置（自研），E-200显微镜（尼康公司），THZ-98AB型恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），LDZX-75KBS型高压灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司），精密微孔滤膜（Millipore公司）。

1.2 试验材料

中空纤维超滤膜组件（天津膜天膜科技有限公司）；试验菌及培养基：试验菌：缺陷假单胞菌1.1860(中国普通微生物菌种保藏管理中心)；培养基：标准琼脂培养基、加氯乳糖肉汤培养基、大豆酪蛋白消化物培养基、大豆酪蛋白消化物琼脂培养基（上述培养基均购自青岛海博生物技术有限公司）。

2 试验方法与步骤

2.1 试验原理

配制一定浓度的缺陷假单胞菌测试原液(活菌浓度A大于109C.F.U/1000mL)在一定的操作压力下透过超滤膜组件,获得一定浓度的滤出液（活菌浓度B一般应大于10C.F.U/1000mL）。通过下式判断超滤膜组件对于细菌的截留能力：

U：细菌截留性能（无量纲）；A：1000mL试验溶液中试验菌的活菌数（C.F.U）；B：相当于1000mL过滤水中试验菌的活菌数（C.F.U）。

2.2 测试菌的准备

2.2.1菌种的鉴定与培养

确定菌种的纯度进行如下鉴定操作：

a进行36h～48h培养。缺陷假单胞菌菌群呈带黄的灰褐色、微膨且有光泽的圆形，在30℃条件下，36 h～48 h后其直径变为1～2mm。

b进行革兰氏染色。确定染色标本为革兰氏阴性，约（0.3～0.4）μm×（0.6～1.0）μm的杆菌，主要以单细胞存在。

c进行鞭毛染色。用油镜观察标本，确认缺陷假单胞菌具有一条极鞭毛。

d进行生化特征鉴定。生化特征鉴定结果：

芽孢形成为-、葡萄糖氧化发酵培养基（敞开）为-、葡萄糖氧化发酵培养基（密封）为-、3%乙醇氧化发酵培养基（敞开）为+、3%乙醇氧化发酵培养基（密封）为-、吲哚为-、甲基红为-、乙酰甲基甲醇为-、白明胶酶为-、需氧性为+、过氧化氢酶为+、细胞色素氧化酶为+、马康基琼脂培养基发育为+、硝酸盐还原为+、脱氧核糖核酸为-。

2.2.2浓菌液的配制与浓度测量

2.2.2.1浓菌液的配制

a将保藏的菌种接种到10mL大豆酪蛋白消化物培养基中，于（30±2）℃恒温振荡培养。

b取a中培养的菌液2mL接种到1000mL的加氯乳糖肉汤培养基中，在（30±2）℃恒温振荡培养，即为浓菌液。

2.2.2.2活菌数及总菌数的测定

a测定浓菌液中的活菌数

用吸管取试验菌液，加入葡萄糖水（1 g/L）中，配制成10-3、10-4、10-5倍的稀释液；取0.1mL稀释液，涂抹到活菌数测定用大豆酪蛋白消化物琼脂培养基上，在（30±2）℃培养48 h，数出菌群数，以求得试验菌液的活菌数。

b测定过滤水中的活菌数

取1000mL产水用精密微孔滤膜过滤，应尽量去除附着在过滤膜表面的水分，然后从装置上取下，将精密过滤膜的里面密封到活菌数测定用琼脂培养基上，在（30±2）℃下倒置培养48 h以上，培养后，数出精密过滤膜上生长的菌群数，计算出相当于样品中的活菌数，同时按照菌种鉴定方案鉴定检出菌是否为添加菌。

c总菌数的测定

将试验菌液在洁净台内用葡萄糖水（1 g/L）稀释，稀释倍率为10-3、10-4、10-5倍，对上述稀释液分别用光学显微镜测定菌数，然后计算出试验菌液中的菌数。

2.3 测试装置的准备

2.3.1试验装置

本次所用试验装置为自制，材料均采用316L不锈钢，动力为蠕动泵，压力表采用隔膜式压力表，并且设计系统残留体积小，易清洗，对强氧化剂不敏感。装置如图1。

2.3.2测试装置的清洗

a将模型组件安装到装置上。

b向容器中装入清洗用的水，启动泵，清洗所有的管路。反复清洗污染物直至清洗干净，然后用水冲洗。

c取下模型组件，换上试验用超滤膜组件，向装置中加入无菌水，关闭过滤水阀，启动泵，在膜的一次侧清洗约30min。然后，打开过滤水阀，调节膜组件进口阀，使膜组件出口压力为0.01～0.1MPa，在膜的二次侧清洗约30min。更换水进行冲洗。

2.3.3装置的杀菌

在装置的清洗工作完成后，向装置中加入双氧水或次氯酸钠溶液，灭菌30min。

2.3.4测试用精密微孔滤膜的灭菌

用于细菌活菌数测定的平板滤膜灭菌方法：将剪好的膜片放入培养皿中，并加入超过膜片的蒸馏水，放入高压灭菌锅中灭菌。

2.4 测试步骤

2.4.1向过滤装置中加入无菌水，启动泵，调节膜组件进口水温为（20～30）℃的范围，并计算平均膜压差和回收率。

膜压差计算公式如下：Pmin=[（Pi+Po）/2]-Pp

Pmin：平均膜压差（kPa）；Po：膜组件出口压力（kPa）；Pi：膜组件进口压力（kPa）；Pp：过滤水压力（kPa）。

回收率应在50%以下，计算公式如下：R=（QP/Qi）×100

R：回收率（%）；QP：过滤水流量（m3/h）；Qi：膜组件进口量（m3/h）。

2.4.2取过滤水1 000mL测定活菌数，作为空白试验（空白试验检出活菌则整个试验无效）。

2.4.3把浓试验菌液加到容器中，并将试验菌液浓度调节到106C.F.U./mL以上。

2.4.4加入菌液以后，取过滤水1 000mL、试验菌液约10mL，并测定活菌数。

2.4.5计算细菌截留性能。

3 结果与讨论

3.1 凝胶层的形成对截留率的影响

在温度相同的条件下，采用不同的压力进行超滤试验。如图2所示。

在相同的压力下，随着时间的增加溶液的通透量在减少，但减少的幅度也在减小。而在不同的压力情况下，压力较小时，随着压力的增加，透液通量增加较快，压力越大溶液的通透量增加减缓。在过滤的开始阶段，膜的污染较少，菌液流动速度较快，超滤阻力主要为超滤膜本身的机械阻力Rm，菌液通量与压力Δ可近似用下式表达：J=ΔP／Rm，所以增加压力就可增加溶液通透量。随着压力的增加，膜的污染在增强，细菌在膜表面的浓度在逐渐增大，当细菌浓度大到某一数值就形成了凝胶层，凝胶层的形成增加了透膜阻力。菌液通量与压力ΔP可近似用下式表达：J=ΔP/Rm+Rc+Rf，其中Rc为凝胶层阻力，Rf为污染阻力。

在压力相同的情况下，随着时间的增加，膜的通量在减小也说明凝胶层的逐渐形成及膜的污染在增强，见图3。

超滤膜运行初期，膜面不会形成凝胶层，截留效率的主要贡献因素是膜组件的机械截留。此时，是超滤膜细菌截留性能最接近由自身机械阻力所引起的截留性能的时候。随着运行时间或压力的增加，膜面会逐渐形成凝胶层并且会增强膜组件的截留作用。此外，凝胶层的形成还会减小菌液的浓度，从而对评价超滤膜的真实细菌截留性能产生影响，所以应当尽量减少凝胶层的形成。可以采取的措施菌液的流速，但是在本实验中也不能无限制增加流速，因为流速增加会加大剪切力，对于菌体有损伤。同样，温度的升高会使菌液粘度降低，减少浓差极化现象，增大膜通量，但是温度太高同样会对细菌产生损伤作用，本实验中采用温度为25℃～30℃。

3.2 不同运行时间对截留率的影响

试验开始时计时，每次取产水100mL，浓水10mL，以下计数相当于1000mL水中的菌数见表1。

表1 不同运行时间下细菌截留性能

由表1可以看出随着试验时间的增加，总菌数和浓水的活菌数，数量有较大的变化，这和滤膜对试验菌的吸附有关，时间越长则滤饼的厚度越大，吸附的试验菌也就越多，对试验的影响也较大，因此在实验操作允许的情况下，尽量缩短加入试验菌到取样的时间，但是考虑试验菌液充分混匀，我们试验选择10min后取样。

3.3 不同运行压力对截留率的影响

在超滤膜允许的压力条件下，采用相同的运行时间（10min），测试不同膜压差下超滤膜的细菌截留性能见表2。

表2 不同压力下细菌截留性能

由表2可以看出，在超滤膜组件的允许压力下，试验压力对截留率的影响不大，但是考虑到膜的浓差极化现象，我们采用的压力略低于膜的操作压力。

3.4 浓菌液培养模式的确定

我们对保存菌种配置浓菌液分别进行如表3时间模式的培养。

表3 培养的时间模式

试验菌液的浓度必须经过严格的培养达到测定所需的菌液浓度，即106/mL以上。通过以上培养结果可以看出，第一代培养时间为24 h和第二代培养时间为24 h的菌长势最好。原因是无论第一代培养或是第二代培养时间太长都会使培养基的养分耗尽，从而使试验菌的生长提前进入衰退期，无法达到最大菌量。

综上所述，我们采用缺陷假单胞菌作为测试菌评价超滤膜组件的细菌截留性能，试验开始10min后取样，操作压力略低于超滤膜组件的操作压力，温度采用25℃～30℃能较为理想的评价超滤膜组件的细菌截留性能。

Research for assessing the bacterial retention ability of ultrafiltration membrane

LIU Shi-dong,YU Xiao-yan,YU Tao
（National Center of Ocean Standardsand Metrology,Tianjin 300112,China）

First,we make a review of research achievement on the assession of the bacterial retention ability of ultrafiltration membrane.Then experiment of the detection of bacterial retention ability of ultrafiltration membrane is designed to provide proof for the assession of the bacterial retention ability of ultrafiltration membrane.

ultrafiltration membrane;bacterial retention;detection

10.3969/j.issn.1008-1267.2011.01.022

O648.2+2

1008-1267（2011）01-056-04

A

超滤是介于微滤和纳滤之间的一种膜过程，膜孔径在1 nm至50 nm之间，但在实际应用中一般不以孔径表征超滤膜，而是以截留分子量表征。与微滤膜一样，超滤膜也被视为多孔膜，主要用于分离溶液中的大分子、胶体和微粒。

超滤膜除了用于常规的过滤外，还被经常用于液体的冷消毒。许多国家对于用于冷消毒的超滤膜有较高的要求，如对包囊、细菌以及病毒等有机体有较高的去除率等。法国卫生部认为只有截留分子量不超过40000Da并且完整的超滤膜才能作为冷消毒使用；美国食品药物管理局要求用于无菌产品的过滤器需要由生产商提供细菌截留性能参数。

在膜对有机体和微生物截留和去除研究领域，美国材料和试验协会和日本工业标准调查会发布了一些有关的标准，例如：ASTM F838-05、ASTM D 3863-87（2003）、ASTM D 3862-80（2001）、JIS K 3835-1990（2006）、JIS K 3823-1990（2006）、JIS K3824-1990。这些标准主要内容是以缺陷假单胞菌（ATCC19146或称NBRC14213）悬浮液来评价液体过滤器的细菌截留性能。目前，在这一领域我国并未建立相关的检测标准。

2010-09-13

刘士栋，男，工程师，主要研究方向为微滤膜，超滤膜及反渗透膜检测。