杜仲、千年健对去卵巢大鼠骨质疏松症的治疗作用及其机理探讨*

张 颖，Gary Guishan Xiao，荣培晶，刘梅洁，汪文莱，王少君，于智敏，刘 红，潘静华，于 峥，赵宏艳，鞠大宏△

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;2.Osteoporosis Research Center，Creighton University，USA;3.中国中医科学院针灸研究所，北京 100700)

绝经后骨质疏松症(PMOP)是一种与衰老有关的常见病，主要发生在绝经后妇女。由于雌激素缺乏导致骨量减少及骨组织结构变化，伴有骨脆性增加及易导致骨折的一种慢性疾病，属中医“痹证”、“骨痿”等范畴。中药杜仲、千年健均有补肾健骨的作用。如《神农本草经》记载杜仲药效为“补中，益精气，坚筋骨……久服轻身耐老”。《饮片新参》记载千年健的功效为“强筋骨，治肢节酸疼”。基于以上认识，本实验以去卵巢大鼠为模型，以探讨杜仲和千年健对骨质疏松症的治疗作用和机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用雌性 Wistar大鼠72只，清洁级，体重230g～270g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(动物许可证号SCXK-(军)2002-001)。动物于中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室内饲养(实验动物室许可证号SYXK(京)-2005-0024)。

1.1.2 药物 杜仲购自四川省宜宾市中宏药业有限公司，经中国中医科学院中药研究所生药室鉴定，为杜仲科(Eucomiaceae)杜仲属杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮。千年健购自广西平安堂药业有限责任公司，经中国中医科学院中药研究所生药室鉴定，为天南星科(Araceae)千年健属千年健 Homalomena occulta(Lour.)Schott的干燥根茎。以上各药加水煎煮，药液浓缩至1g生药/ml的浓度。

1.1.3 主要试剂 大鼠护骨素 (Osteoprotegerin，OPG)、细胞核因子-κB 受体活化因子配基(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)免疫组化试剂盒:美国 Santa cruze;大鼠 OPG、RANKL原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供;盐酸四环素由欣惠泽奥科技有限公司公司提供。

1.1.4 主要仪器 OM2563冰冻切片机:美国TBS公司;Reicheit-Jung2040切片机:德国;Qwin图像分析仪系统:德国Leica公司;Wellwash 4 Mk2洗板机:美国 Thermo公司;Multiskan Mk3酶标仪:美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理 选将72只大鼠随机分为3组，其中空白对照组12只，假手术组12只和造模组48只。造模组大鼠用戊巴比妥钠麻醉后摘除双侧卵巢［1］，假手术组只摘取少量脂肪组织。术后1个月再将造模组大鼠随机分为模型组、阳性对照组、杜仲组、千年健组4组，每组12只。然后开始灌胃给药，杜仲组、千年健组为1g生药/mL的水煎剂，给药体积为5.6mL/kg体重，即给药剂量均为5.6g生药/kg体重;阳性对照组给予0.008mg/mL己烯雌酚，给药体积为 5.6mL/kg体重，即给药剂量为0.0448mg/kg体重。空白对照组、假手术组、模型组则灌服等体积的蒸馏水。以上灌胃给药3个月，1d 1次，连续6d，休息1d。大鼠处死前15d和前3d腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重，对骨进行荧光标记。给药结束后，各组大鼠以45mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，股动脉取血。大鼠处死后取右侧胫骨制作不脱钙骨切片，取左侧胫骨制作脱钙的冰冻切片。

1.2.2 指标的检测方法 骨组织形态计量学指标的测定:取右侧胫骨近端1/3，除净周围附着的软组织，采用塑料包埋方法制作不脱钙骨切片:一张切片进行甲苯胺蓝染色，另一张切片直接用于荧光观察。采用Leica Qwin图像分析系统，按章明放等人的方法对不脱钙骨切片进行形态计量［2］。

成骨细胞(OB)和骨髓基质细胞(MSC)OPG、RANKL蛋白及其mRNA表达的检测:取左侧胫骨近端1/3，按照文献［3］中所述方法进行标本处理，采用免疫组化方法检测OB和MSC OPG、RANKL蛋白的表达，采用原位杂交法检测其mRNA表达。并用Leica Qwin图像分析系统对OPG、RANKL蛋白及其mRNA表达阳性密度进行计量。

2 结果

2.1 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨组织形态计量学指标的影响

2.1.1 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨小梁体积百分比(TBV%)的影响 表1显示，模型组大鼠胫骨TBV%较假手术组明显降低。杜仲组、千年健组TBV%显著高于模型组，明显低于假手术组。阳性对照组TBV%显著高于模型组，与假手术组相比无显著性差异。

表1 各组大鼠胫骨TBV%的变化

2.1.2 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨小梁吸收表面百分比(TRS%)的影响 表2显示，与假手术组相比，模型组大鼠胫骨 TRS%显著升高。杜仲组、千年健组TRS%明显低于模型组，明显高于假手术组。与模型组相比，阳性对照组TRS%显著降低，与假手术组相比无显著性差异。

2.1.3 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨小梁形成表面百分比(TFS%)、骨小梁矿化率(MAR)的影响

表2 各组大鼠胫骨TRS%的变化

表3显示，模型组大鼠胫骨 TFS%、MAR较假手术组显著增高，千年健组TFS%、MAR明显低于模型组，而杜仲组无显著性变化。与假手术组相比，杜仲组、千年健组 TFS%、MAR明显增高。阳性对照组TFS%、MAR与模型组相比明显降低，与假手术组相比无显著性差异。

2.1.4 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨皮质矿化率(mAR)和骨皮质类骨质平均宽度(OSW)的影响 表4显示，模型组大鼠胫骨mAR和OSW皆高于假手术组。与模型组相比，千年健组和OSW明显降低，mAR无显著性差异，杜仲组mAR和OSW均无显著性改变;与假手术组相比，杜仲组和千年健组mAR明显升高，OSW均无显著性差异。阳性对照组的mAR和OSW与模型组比较，显著降低，与假手术组相比无显著性差异。

表3 各组大鼠胫骨TFS%和MAR的变化

表4 各组大鼠胫骨mAR和OSW的变化

2.2 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB、MSC OPG和RANKL蛋白表达的影响

2.2.1 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB和MSC OPG蛋白表达的影响 表5显示，模型组大鼠胫骨OB和MSC OPG蛋白表达阳性密度均明显低于假手术组。与模型组相比，千年健组 OB和MSC OPG蛋白表达均明显升高，杜仲组无显著性差异;与假手术组相比，杜仲组、千年健组OB和 MSC OPG蛋白表达阳性密度均明显降低。阳性对照组OB和MSC OPG蛋白表达阳性密度均明显高于模型组，与假手术组相比无显著性差异。

表5 各组大鼠胫骨OB和MSC OPG蛋白表达的变化

2.2.2 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB和MSC RANKL蛋白表达的影响 表6显示，与假手术组相比，模型组大鼠胫骨OB和MSC RANKL蛋白表达阳性密度均明显升高。与模型组相比，杜仲组、千年健组 OB和 MSC RANKL蛋白表达明显降低。与假手术相比，杜仲组MSC RANKL蛋白表达阳性密度升高，OB RANKL蛋白表达无显著性差异;千年健组OB和MSC RANKL蛋白表达阳性密度较假手术组均明显升高。与模型组相比，阳性对照组OB和MSC RANKL蛋白表达阳性密度明显降低，与假手术组相比无显著性差异。

表6 各组大鼠胫骨OB和MSC RANKL蛋白表达的变化

2.3 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB和MSC OPG和RANKL mRNA表达的影响

2.3.1杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨OB和MSC OPG mRNA表达的影响 表7显示，模型组大鼠胫骨OB和MSC OPG mRNA表达阳性密度较假手术组显著降低。千年健组OB和MSC OPG mRNA的阳性密度明显高于模型组，而杜仲组则无显著性变化。与假手术组相比，杜仲组、千年健组 OB和MSC OPG mRNA表达均明显降低。阳性对照组OB和MSC OPG mRNA表达较模型组明显升高，与假手术组相比无显著性差异。

表7 各组大鼠胫骨OB和MSC OPG mRNA表达的变化

2.3.2 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB和MSC RANKL mRNA表达的影响 表8显示，模型组大鼠胫骨OB和MSC RANKL mRNA表达阳性密度均明显高于假手术组。与模型组相比，杜仲组、千年健组OB和MSC RANKL mRNA表达均明显降低;与假手术组相比，千年健组 MSC RANKL mRNA表达阳性密度明显升高，杜仲组OB和MSC RANKL mRNA表达以及千年健组OB RANKL mRNA表达均无显著性差异。阳性对照组OB和MSC RANKL mRNA表达阳性密度均明显低于模型组，与假手术组相比无显著性差异。

表8 各组大鼠胫骨OB和MSC RANKL mRNA表达的变化

与空白对照组比较，假手术组的上述指标均无显著性差异，从而排除了手术本身对实验的影响。

3 讨论

绝经后骨质疏松症是由于绝经后雌激素迅速减少致使骨量丢失加快［4］。本研究以卵巢切除大鼠为模型，结果发现卵巢切除后大鼠胫骨TBV%显著降低，代表骨吸收参数的TRS%和代表骨形成参数的TFS%、MAR、mAR和 OSW 均显著增高，因此本实验模型与人类绝经后骨质疏松症的发病机理相似，为骨吸收大于骨形成的高转换型骨质疏松症模型。给药3个月后，杜仲组的TBV%和TRS%均有明显逆转;千年健组除mAR以外，其他指标均明显逆转。由此可见，杜仲主要以降低骨吸收来达到对骨质疏松症的治疗，而千年健既能抑制骨吸收，同时又能抑制骨形成，使骨形成大于骨吸收而达到对骨质疏松症的治疗作用。

模型组大鼠胫骨OB和MSC OPG蛋白及其mRNA的表达均明显低于假手术组，OB和 MSC RANKL蛋白及其mRNA的表达均明显高于假手术组，提示当雌激素缺乏时则抑制OB和MSC OPG蛋白表达减少，但促进 RANKL蛋白的表达。现代研究发现，OPG、RANKL是非常重要的破骨细胞分化调节信号因子。OPG对破骨细胞的作用是多方面的，它可以抑制破骨细胞的分化、融合、激活，并促进破骨细胞凋亡。RANKL是直接刺激破骨细胞发育和使之激活的细胞因子，它与破骨细胞表面受体RANK结合，强有力地促进破骨细胞的形成、分化、成熟，并抑制破骨细胞凋亡，延长其存活［5］。本实验结果显示，杜仲组、千年健组 OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA的表达较模型组均明显降低，提示杜仲和千年健对大鼠胫骨OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA的表达有明显的抑制作用;同时，千年健组OB和MSC OPG蛋白及其mRNA表达较模型组均明显提高，表明千年健对OB和MSC OPG蛋白及其mRNA表达有一定的促进作用。

综上所述，杜仲、千年健对卵巢切除所致的大鼠骨质疏松症均具有一定的治疗作用。从治疗作用环节来看两者各有特点:千年健不仅可以增加OB和MSC OPG蛋白及其 mRNA表达，还能抑制RANKL蛋白及其 mRNA的表达;杜仲是通过抑制 OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA表达，从而达到治疗骨质疏松症的目的。

［1］鞠大宏，张春英，王安民，等.温补肾阳方对去卵巢所致骨质疏松症大鼠IL-1和IL-6活性的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2000，6(4):29-32.

［2］章明放，张乃鑫，谭郁彬.运动对雌性大鼠去势后骨质疏松症的作用［J］.中华骨科杂志，1994，14(6):365-369.

［3］鞠大宏，于福禄，张丽坤，等.滋阴补肾法对卵巢切除所致骨质疏松大鼠成骨细胞COX-2蛋白和 mRNA表达的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2006，12(12):918-920.

［4］马俊岭，郭海英，侯钦午.绝经后骨质疏松症的病因病理［J］.淮海医药，2010，28(5):3-4.

［5］刘梅洁，鞠大宏，赵宏艳.“肾主骨”的机理研究—左归丸含药血清对破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL蛋白表达的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2009，15(3):184-187.