分批发酵和补料分批发酵结合生产透明质酸的研究

邓开野，谭梅唇

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225；2.广西大学，广西南宁530004）

分批发酵和补料分批发酵结合生产透明质酸的研究

邓开野1，谭梅唇2

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225；2.广西大学，广西南宁530004）

采用单一补料分批培养方式进行补料发酵时，对发酵过程中菌体生长，产物合成以及副产物的影响进行研究。结果表明：该方法可以通过改善发酵过程中环境条件，来提高透明质酸（HA）的产量。和分批发酵相比，发酵液中HA的量提高大约3.5%。HA发酵可以采用单一补料分批发酵的方法来提高生产强度，缩短发酵周期，有效地降低生产成本，是一种可以有效提高HA发酵生产性能指标的现代发酵技术。

分批发酵，补料分批发酵，透明质酸

补料分批培养兼有分批培养和连续培养的优点，并在某种程度上克服了它们所存在的缺点。和分批培养方式相比，此方法可以解除培养过程中的底物抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖的分解阻遏效应；对于耗氧过程，可以避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成的细胞大量生长、耗氧过多以致通风搅拌设备不能匹配的状况；在某种程度上可以减少微生物细胞的生成量、提高目的产物的转化率；微生物细胞可以被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来控制细胞的质量；并可重复某个时期细胞培养的过渡态，可用于理论研究。和连续培养方式比较，此方法不需要严格的无菌条件；不会产生微生物菌中的老化和变异；最终产物浓度较高，有利于产物的分离，使用范围广［1－2］。本研究对分批培养和单一补料分批培养方式进行了比较研究，考察了葡萄糖的变化状况，以及分别采用两种方式生产HA过程中，菌体的生长、HA的合成和发酵副产物乳酸的变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种 实验室筛选和诱变出的产生透明质酸的变异株；种子培养基 2%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏 1%，NaNO30.4%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，调pH7.0，121℃灭菌20min；发酵培养基 4%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏1%，硝酸钠0.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，调pH7.0，121℃灭菌20min。

1.2 实验方法

1.2.1 斜面与种子培养方法 将筛分的菌种于斜面培养基上划线传代。将斜面试管放在恒温箱中，在37℃条件下培养14～16h。培养结束后，用接种针在斜面培养基中挑取生长状态良好的菌落2～3环，接入250mL三角烧瓶中，烧瓶内装50mL种子培养基，把接菌后密封好的250mL三角烧瓶置于以200r/min旋转的摇床中培养16h，培养温度37℃。

1.2.2 摇瓶培养方法 培养结束后，按10%的接种量计算，从250mL三角烧瓶中吸取0.2mL已培养好的菌液，接入500mL三角烧瓶，内装发酵培养基20mL。再将此500mL三角瓶置于转速为200r/min的摇床中振荡培养，在37℃条件下培养24h。

1.2.3 分批培养和补料分批培养比较

1.2.3.1 分批培养 于10L的发酵罐（江苏达森）中加入6L发酵培养基，121℃下灭菌30min，初始搅拌转速 100r/min，不断地提高转速，直到转速达到200r/min。接种后开始主发酵直至发酵结束，从发酵液中提取HA。分批发酵淀粉水解液的初始葡萄糖浓度为5%。

1.2.3.2 补料分批培养 在10L的发酵罐中加入4L的发酵培养基，121℃下灭菌30min，初始搅拌转速100r/min，不断地提高转速，直到转速达到200r/min。初始葡萄糖浓度为3%，每隔一段时间，取样分析发酵液中的葡萄糖含量，待发酵体系中葡萄糖浓度1%时，便补加葡萄糖浓度为5%的新鲜培养基，控制发酵体系中的葡萄糖浓度为2%，直至发酵液的总体积为6L为止，便停止补料。

1.2.4 测定方法

1.2.4.1 吸光度（OD值）的测定 发酵液50mL在4000r/min条件下离心15min后，在上清液中加入3倍体积的乙醇，析出的沉淀加入与发酵液同体积的0.1mol/L NaCl溶液，置于磁力搅拌器，在196nm处测定发酵液的吸光度，该吸光度值的大小可以指示发酵液中透明质酸含量的高低。

1.2.4.2 菌体含量的测定 采用干重法。将发酵液离心后取沉淀，加稀酸溶解碳酸钙，再离心取沉淀，80℃干燥24h后，称取重量，计算细胞浓度。

1.2.4.3 乳酸含量测定 对羟基联苯法［3］。

1.2.4.4 其他指标的测定 透明质酸含量测定：采用Bitter－Muir氏法［4］；比旋光度的测定：称取5mg HA，用蒸馏水溶解后，装入10cm比旋管，在比旋仪上测定；葡萄糖含量测定：3，5－二硝基水杨酸法［5］。

2 结果与分析

2.1 紫外吸收光谱

将sigma公司的HA标准品和发酵液的提取物均分别配制成500!g/mL的水溶液，使用紫外分光光度计在190～300nm波长范围内进行扫描。两者均在波长196nm处出现多糖特征峰。标准样品HA和发酵液提取物的紫外扫描结果分别如图1和图2所示。

图1 HA标准品的紫外图谱

图2 发酵液提取物的紫外图谱

从图中可以看出，发酵液提取物的粗品HA的紫外光谱在196nm处有特征吸收峰，同sigma公司的HA标准品的特征吸收峰相同，表明利用其最大波长处紫外光谱分析可以作为衡量发酵液中HA含量多少的依据。

2.2 分批培养和补料分批培养的葡萄糖浓度的变化

图3为分批发酵过程和补料分批发酵过程中葡萄糖浓度的变化曲线。由图可知，在分批发酵过程中，葡萄糖的初始浓度值较高，为5%，由于在整个过程中没有再补充，所以一直呈下降的趋势，待菌体的对数生长期和稳定期时，底物中葡萄糖的含量不是很高，对产物的积累有一定的抑制作用，而且由于初期的高葡萄糖浓度，容易造成中间产物的积累，如乳酸等，又会对产物也形成抑制作用。

图3 分批培养和补料分批培养的葡萄糖消耗曲线

而补料分批培养则克服了上述的缺点，初始的葡萄糖浓度为3%，当底物的葡萄糖浓度降低到1%左右时，开始补加新鲜的培养基。这样度过了滞后期的菌体在对数生长期和稳定期中，可以处于比较稳定的环境中进行生长和产物的积累，对获得高得率产物有促进作用。

2.3 分批培养和补料分批培养方式对菌体生长的影响

图4 分批培养和补料分批培养对菌体生长的影响

由图4可知，在主发酵前期，两种培养方式对菌体生长的影响并没有太大的差别。分批培养过程中，菌体量呈稳定的上升趋势，在12～16h范围内为对数生长期，因此菌体量增加速度较快，而稳定期则是在16～22h，然后开始呈下降趋势。而从补料分批培养的菌体生长曲线可以明显地看出，菌体在6h左右就开始迅速增长，经过对数生长期之后，由于补充了新鲜的培养基，此时发酵液中的养分比较完全，所以，在14～26h范围内，菌体处于稳定期内，此培养方式可以令菌体的稳定期维持较长时间，这是任何一种工业发酵所期望的，因为长的稳定期可以促使产物的积累，延长产物积累时间，就意味着产率的提高。

2.4 分批培养和补料分批培养方式对HA合成的影响

由图5可以看出，采用补料分批培养的方式，在发酵液中HA的积累速度要快于分批培养中产物的积累，并且从产物积累开始，HA的量就高于分批培养发酵液中HA的含量，这和图3和图4所获得的结果相偶联。

图5 分批培养和补料分批培养对HA合成的影响

2.5 分批培养和补料分批培养方式对乳酸合成的影响

链球菌的生长都伴随着乳酸的形成，乳酸和乙酸是其中最主要的两种。不过乙酸的形成量很少，只是乳酸的10%，所以本研究忽略了乙酸，对此不做分析。图6为分批培养和补料分批培养过程中乳酸的变化曲线。然而，乳酸的大量形成，对HA的合成会产生抑制。

图6 分批培养和补料分批培养对乳酸合成的影响

由图6可以看出，对于分批发酵，从6h开始到16h左右，发酵液中乳酸的增加比较迅速，而最大值可达到61.4g/L。而补料分批发酵过程中，乳酸的量则一直呈上升的趋势，且含量比较高。这是由于和分批培养相比较，补料的操作使得培养液中的葡萄糖含量在发酵后期要高些，这是因为该菌株生长代谢所需要的能量主要依靠葡萄糖不完全代谢而生成乳酸和乙酸所提供，所以在整个补料分批培养过程中，乳酸的量一直在增加。

3 结论

3.1 本研究采用补料分批培养方式进行补料发酵时，通过对发酵过程中菌体生长，产物合成及副产物的影响来看，该方法可以通过改善发酵过程中环境条件，来提高HA的产量。和分批发酵相比，发酵液中HA的量提高大约3.5%。

3.2 HA发酵可以采用补料分批发酵的方法来提高生产强度，缩短发酵周期，有效地降低生产成本，是一种可有效提高HA发酵生产性能指标的现代发酵技术。

［1］郭学平，王春喜，崔大鹏.发酵法制备透明质酸［J］.日用化学工业，1994（2）：47.

［2］郭学平，王春喜，凌沛学，等.透明质酸及其发酵生产概述［J］.中目生化药物杂志，1998，19（4）：209.

［3］Barker S B，Summerson W H.The Colorimetric determination of lactic acid in biological material［J］.J Biol Chem，1949，138：535－554.

［4］Bitter T，Ewins R.Modified carbazole reaction for uronic acid［J］.J Biol Chem，1961，81：43.

［5］Miller G L.Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1960，31（3）：426－428.

Study on producing hyaluronic acid by compound of batch fermentation and batch－feeding fermentation

DENG Kai－ye1，TAN Mei－chun2
（1.College of Light Industry and Food Technology，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；2.Guangxi University，Nanning 530004，China）

The single batch－feeding fermentation was adopted.The biomass growth，product synthesis，effects of byproducts were studied during the course of fermentation.The results showed it could improve the HA yield through improving the environmental condition during the course of fermentation.Comparing with batch fermentation，HA yield could be increased 3.5%.HA fermentation can improve the production intensity，shorten fermentation period，decrease the cost by single batch feeding fermentation.

batch fermentation；batch－feeding fermentation；hyaluronic acid

TS201.1

A

1002－0306（2011）01－0166－03

2010－01－06

邓开野（1968－），女，博士，副教授，研究方向：发酵工程。