淫羊藿女贞子合用糖皮质激素抗哮喘大鼠的实验研究

刘仁慧，许利平，杨婧

本实验在前期研究已建立的哮喘大鼠模型的基础上[1]，给予地塞米松干预治疗2周，并同时配合服用淫羊藿女贞子煎剂，观察淫羊藿女贞子合激素干预治疗对哮喘大鼠气道炎症、糖皮质激素作用途径等的影响作用，为后期应用平补阴阳中药协同激素干预哮喘模型提供实验与理论依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠，体重（120±10）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(合格证号：SCXK-（军）2007-004)。

1.2 试剂与药品

卵清白蛋白（OVA）、氢氧化铝凝胶、地塞米松（Dex），美国 Sigma公司；地塞米松磷酸钠注射液，天津药业焦作有限公司；促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（COR）放免试剂盒，北京北方生物技术研究所；促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）放免试剂盒，北京华英生物技术研究所；大鼠IL-4、IL-5、INF-γ酶免试剂盒，上海朗顿生物科技有限公司；糖皮质激素受体（GCR）单克隆一抗，美国Abcam；Fitc-GCR二抗，北京成文化学免疫研究室；Fitc- Dex，美国Molecular Probes。淫羊藿、女贞子药材均购于北京同仁堂药店。

1.3 实验器材

402A超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；雾化箱，以有机玻璃为材料自制，规格：40×30×20cm3；XH6080放免仪，西安核仪厂；酶标仪，Denley Dragon Wellscan MK2型USA；流式细胞仪FACS Calibur，美国BD公司。

2 方法

2.1 分组方法

按随机数字表法分为5组，即正常对照组（N组）、哮喘模型组（A组）、激素干预组（GC组），淫羊藿女贞子组（YN组），淫羊藿女贞子合激素干预组（YN+GC组），每组8只。

2.2 造模、给药方法

实验d1-35，除正常对照组外，其余动物全部造模[1]。实验d36-48，激素干预组、淫羊藿女贞子合激素干预组 ip 地塞米松注射液0. 5 mgkg-1，qd，连用2周；淫羊藿女贞子组、淫羊藿女贞子合激素干预组ig淫羊藿女贞子水溶液（9. 5 gkg-1），qd，连用2周；同时，除正常对照组外，其余动物每周2 次给予1%OVA 雾化吸入直至实验结束。

2.3 取材处理

大鼠腹腔麻醉, 腹主动脉取血, 分离取血清及血浆。血清用于COR检测；血浆用于ACTH 检测。右肺行支气管肺泡灌洗术，回收支气管肺泡灌洗液（BALF），分离BALF上清液，用于IL-4、IL-5、INF-γ检测，BALF沉淀加4%多聚甲醛固定，用于GCR检测。断头后, 迅速摘取下丘脑，用于CRH 检测。

2.4 观测指标与检测方法

2.4.1 IL-4、IL-5、INF-γ 按照试剂盒说明书，采用ELISA法检测。

2.4.2 COR、ACTH、CRH 按照试剂盒说明书，采用RIA法检测。

2.4.3 GCR含量的检测 采用流式细胞法。GCR蛋白表达检测：BALF沉淀0.5 mL，PBS 洗2次；加入破膜剂（0.1% Triton-X 100 -10%山羊血清-PBS）重悬细胞，冰上静置后离心，PBS 洗涤1次；吸弃上清，加入GCR一抗，同型对照管中加入等量IgGl，冰上避光静置；PBS 洗涤1次，加入Fitc-GCR二抗，冰上避光静置；PBS洗涤2次，弃上清；2%多聚甲醛重悬固定，4℃避光保存，上机检测。GCR结合力检测：BALF沉淀0.5 mL，PBS 洗涤2次；加入破膜剂重悬细胞，冰上静置后离心，PBS洗涤2次；100 μLPBS重悬，37℃孵育10 min，加入2×10-5M Fitc-Dex，对照管提前10 min加入500倍于Fitc-Dex的Dex做为同型对照， 37℃，室温避光静置60 min，PBS洗涤2次，弃上清；2%多聚甲醛重悬固定，4℃避光保存，上机检测。GCR的表达量用单细胞表达量的平均荧光强度表示。

2.5 统计学方法

数据采用均数±标准差（x¯±S）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，根据方差齐性检验结果选择LSD（方差齐）或Tamhane’s T2（方差不齐），采用SPSS 11.0 for Windows软件包完成。

3 结果

3.1 各组大鼠BALF INF-γ、IL-4、IL-5的比较（见表1）

表1 各组大鼠INF-γ、IL-4、IL-5的比较（x¯±S，n=10）

结果显示：与正常对照组比较，哮喘模型组BALF 中INF-γ含量明显降低（P0.01），IL-4、IL-5含量明显升高（P0.01、0.05）。与哮喘模型组比较，各给药组均能显著抑制升高的IL-4含量（均P0.01），此外淫羊藿女贞子合激素干预组可显著升高INF-γ含量及INF-γ IL-4比值（P0.05、0.01），激素干预组可显著升高INF-γ IL-4比值（P0.01）。

3.2 各组大鼠血清COR、血浆ACTH、下丘脑CRH含量的比较（表2）

表2 各组大鼠COR、ACTH、CRH的比较（x¯±S，n=10）

结果显示：COR、ACTH、CRH含量哮喘模型组较正常对照组均无差异，而激素干预组均较正常对照组、哮喘模型组显著改变（P0.05或0.01）；淫羊藿女贞子合激素干预组与激素干预组比较，ACTH、CRH含量有显著差异（均P0.01），COR含量有升高的趋势。

3.3 各组大鼠BALF 中GCR蛋白表达和结合力的比较（表3）

表3 各组大鼠GCR蛋白的比较（x¯±S，n=6）

结果显示：与正常对照组比较，哮喘模型组GCR蛋白结合力明显降低（P0.01）。激素干预组GCR蛋白表达量及GCR蛋白结合力较正常对照组与哮喘模型组均降低明显（P0.05或0.01）。与激素干预组比较，淫羊藿女贞子合激素干预组GCR蛋白表达量及GCR蛋白结合力均明显升高（P0.05或0.01）。

4 讨论

Th1/Th2细胞及其细胞因子的失衡是参与哮喘气道炎症的重要发病机制之一，研究表明[2～3]哮喘大鼠的Th1类细胞因子IFN-γ等表达明显下降，Th2类细胞因子IL-4、IL-5等表达明显上升，与本课题的研究结果吻合。GC抑制气道炎症的机制与其调节Th1/Th2平衡有关，对Th1、Th2细胞均有抑制作用，而对Th2细胞的抑制作用更加显著[4～5]。本课题研究表明：激素干预组能显著抑制哮喘大鼠 IL-4水平，对IFN-γ的影响作用不显著，提示GC调节Th1/Th2平衡的作用主要体现在抑制Th2细胞功能亢进。配伍中药淫羊藿女贞子后，结果提示淫羊藿女贞子合激素干预组除具有同激素相似的抑制Th2功能亢进的作用，且能显著上调IFN-γ水平，升高IFN-γ/ IL-4比值，从而双向调节Th1/Th2平衡的作用，达到协同增效的作用。

哮喘存在低皮质醇等HPA 轴不同程度的抑制现象，虽补充外源性GC是治疗哮喘的首选方法，但大剂量地使用GC类药物或长期小剂量地使用此类药物就会引起肾上腺皮质功能的抑制[6～7]，从而导致内源性COR含量显著降低，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能紊乱，GCR数量或功能亦出现异常。本实验结果显示：激素干预组血清COR 、BALF GCR蛋白表达及结合力均显著降低，而ACTH及CRH含量反馈性增高，提示哮喘大鼠给予激素治疗后，内源性GC作用途径受到显著抑制。 GC合用淫羊藿女贞子配伍后，显著下调ACTH、CRH含量，上调GCR含量及蛋白表达，从而对内源性GC作用途径起到保护作用，改善GC 类药物对内源性GC 的抑制。

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