毛脉酸模叶中有效成分提取方法的比较研究＊

王振月，刘颖新，，刘利利

(1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)

毛脉酸模叶中有效成分提取方法的比较研究＊

王振月1，刘颖新1，2，刘利利2

(1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)

目的 筛选毛脉酸模叶有效成分的最佳提取工艺。方法 以毛脉酸模叶中白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄素及出膏率为考察指标，用正交设计试验优化工艺，并通过多指标综合评分比较3种方法。结果 传统索氏提取法最佳提取工艺的综合评分为35.59;复合酶法最佳提取工艺的综合评分为86.41;通过提取原生质体得到有效成分的方法的最佳提取工艺的综合评分为92.17。结论 通过提取叶片中原生质体得到有效成分的方法要优于另外两种方法。

毛脉酸模;提取方法;最佳提取工艺

毛脉酸模 Rumex gmelini Turcz.为蓼科酸模属植物，民间以根入药，以治疗淋病、癣病、疮毒、止血、癌症和调血脂等著称[1]。目前已从毛脉酸模根中分离出酸模素、蒽醌类、二苯乙烯类等化合物。药理研究表明，毛脉酸模具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。笔者以毛脉酸模的叶片为研究对象，用3种不同方法提取叶中有效成分，通过多指标综合评分来比较3种方法的优劣，以期为叶类药材的成分提取提供新的途径。现报道如下。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪;Mettler AE 240型电子天平(瑞士Mettler公司);电热恒温水浴锅(江苏金坛医疗仪器厂);恒温电热套(山东鄄城永兴仪器厂);DHG－9140 A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)。毛脉酸模叶(采于黑龙江中医药大学药用植物园温室，3年生，质量鲜干比为1∶0.179 7);白藜芦醇、白藜芦醇苷对照品(美国SIGMA公司);大黄素对照品(中国药品生物制品检定所);纤维素酶、果胶酶(黑龙江肇东日成酶制剂有限公司)。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Planetsil C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);预柱:Phenomenex ODS 柱(4.0 mm×3.0 mm);流动相:甲醇－0.1%磷酸－水;梯度洗脱条件:流动相从30%甲醇到100%甲醇，分析时间为50 min;流速:1 mL/min;检测波长:254 nm。

2.1.2 供试品溶液制备

传统索氏提取法提取试验供试品溶液:取3年生毛脉酸模叶，在60℃下干燥至恒重。粉碎至不同粒度后精密称取适量，置索氏提取器中，用不同体积分数的乙醇提取一定时间，滤过，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣用5 mL甲醇溶解并定容至刻度，然后过0.45 μm的微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

复合酶法提取试验供试品溶液:取3年生毛脉酸模叶，在60℃下干燥至恒重。粉碎至不同粒度后精密称取适量，加入复合酶，倒入适量一定pH的蒸馏水中，在一定温度条件下反应一段时间后倒入索氏提取器中，用80%乙醇提取4 h，将提取液倒入蒸发皿中蒸干，残渣用5 mL甲醇溶解并定容至刻度，再过0.45 μm的微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

通过提取原生质体[2]得到有效成分的方法(以下简称原生质体提取法)提取试验供试品溶液:取3年生新鲜毛脉酸模叶，经预处理、灭菌、去下表皮、酶解、尼龙筛网过滤、离心处理等步骤后，将提取液倒入蒸发皿中蒸干，残渣用5 mL甲醇溶解并定容至刻度，再过0.45 μm的微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄素对照品适量，用甲醇配制成质量浓度分别为 0.22，0.02，0.19 g/L 的标准溶液，进样测定峰面积。以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系考察结果

精密度试验:取同一供试品溶液，连续进样5次，白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄素峰面积积分值的 RSD＜2%(n=5)，表明仪器精密度符合要求。

重现性试验:取同一样品粉末5份，每份精密称取0.1 g，按传统索氏提取法提取试验供试品溶液制备方法制成供试品溶液，测定峰面积。结果3个次生代谢产物峰面积积分值的 RSD＜4%(n=5)，表明方法重现性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在 0，2，6，18，24 h 时进样测定。结果3个次生代谢产物峰面积积分值的 RSD＜4%(n=5)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验:精密称取已知含量的毛脉酸模粉末样品，分别加入一定量的白藜芦醇苷对照品，按传统索氏提取法提取试验供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定含量，计算加样回收率。结果见表2。

表2 白藜芦醇苷加样回收试验结果(n=5)

2.2 索氏提取法正交试验

2.2.1 提取条件优化

先进行单因素试验，对乙醇体积分数、提取时间、药材粉碎粒度进行研究。分别测定毛脉酸模叶中有效成分的含量和出膏率，并进行多指标综合评分[3]。在此基础上，选取主要影响因素和合适的水平，按L9(34)正交试验设计表的条件进行试验，并作多指标综合评分，确定最佳提取条件。评分时以各指标的最大值为参照，将数据归一化，再给出不同的权重。白藜芦醇苷的权重系数设为0.3，白藜芦醇的权重系数设为0.3，大黄素的权重系数设为0.2，以浸出物多少来代表其他有效成分，并将出膏率设为正权重系数。考虑到出膏率和其他已明确指标成分存在的矛盾，将出膏率的权重系数定为 0.2，以综合值进行统计分析。其中综合评分 Y=0.3 X1×100/此指标最大值 +0.3 X2×100/此指标最大值 +0.2 X3×100/此指标最大值+0.2 X4×100/此指标最大值。

2.2.2 单因素试验

乙醇体积分数:精密称取毛脉酸模叶粉末(80目)0.500 0 g，在其他条件相同的情况下，以不同体积分数的乙醇进行提取，分别测定各有效成分的含量和出膏率，并进行多指标综合评分。结果乙醇体积分数为40%，50%，60%，70%，95%时，综合评分分别为89.821 03，81.782 24，78.492 52，75.401 99，72.523 51。可见，乙醇体积分数为40%时提取效果最好，体积分数为50%和60%的乙醇次之，故选这3个水平进行正交试验。

提取时间:精密称取毛脉酸模叶粉末(80目)0.500 0 g，加入体积分数为50%的乙醇，提取不同的时间，其他条件相同。对得到的滤液定容，分别测定不同提取时间有效成分的含量和出膏率，并进行多指标综合评分。结果提取3，4，5，6，7 h时，综合评分分别为90.849 16，94.934 91，92.231 18，88.832 37，87.348 39。可见，提取4 h已达到最佳效果，故选3，4，5 h进行正交试验。

药材粒度:精密称取不同粒度的毛脉酸模叶粉末0.500 0 g，加体积分数为50%的乙醇提取4 h，其他条件相同。对得到的滤液定容，分别测定不同药材粒度时有效成分的含量和出膏率，并进行多指标综合评分。结果最细粉、细粉、中粉、粗粉、最粗粉的综合评分分别为 69.215 34，73.264 15，85.134 28，82.897 08，77.523 49。可见，中粉已能达到最佳效果，因此选中粉、粗粉、最粗粉进行正交试验。

2.2.3 正交试验设计

为进一步考察索氏提取的提取工艺，精密称取3年生毛脉酸模叶粉末0.503 2 g，对影响提取效果的主要因素乙醇体积分数(因素A)、提取时间(因素B)、药材粒度(因素C)进行正交试验。因素水平见表3。按L9(34)正交试验表分别制备各样品溶液，滤过，蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至25 mL，用微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。分别吸取上述各供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定各指标成分含量和出膏率，并进行多指标综合评分，结果见表4，方差分析见表5。方差分析表明，乙醇体积分数对结果有显著影响，提取时间和粉碎粒度对结果影响不显著。结合直观分析，选定最佳提取条件为A3B3C3，即将药材粉碎成最粗粉，以60%乙醇提取5 h。

表3 索氏提取法因素水平表

表4 索氏提取法正交试验结果(n=3)

表5 索氏提取法方差分析表

2.2.4 验证试验

对筛选出的最佳工艺A3B3C3进行验证试验。结果白藜芦醇苷含量为0.096%，白藜芦醇含量为0.002 9%，大黄素含量为0.038 16%，浸膏得率为27.17%(n=3)，表明工艺达到了优化目的。

2.3 复合酶法提取正交试验

2.3.1 提取条件优化

复合酶法提取中药有效成分的主要影响因素为酶解时间、酶用量、酶解pH和酶解温度。故选取主要影响因素和合适的水平，按L9(34)正交试验设计表的条件进行试验，并作多指标综合评分(评分方法同索氏提取法)，以确定毛脉酸模叶提取的最佳条件。

2.3.2 单因素试验

pH:根据酶制剂产品说明和文献[4]，酶解时最适宜的pH为5，故选pH为4，5，6这3个水平进行正交试验。

温度:根据酶制剂产品说明和文献[4]，酶解时最适宜的温度为50℃，故选40，50，60℃这3个水平进行正交试验。

时间:根据酶制剂产品说明和文献[4]，最适宜的酶解时间为1.5 h，故选 1.0，1.5，2.0 h 这 3 个水平进行正交试验。

复合酶用量:根据文献[5]确定纤维素酶与果胶酶的配比为1∶1时，有效成分的提取效果最佳。精密称取0.500 0 g毛脉酸模叶粉末(80目)，分别加入质量为毛脉酸模叶粉末0.5%，1%，2%，3%，4%，5%的复合酶，在相同温度下酶解相同时间后，用80%乙醇提取4 h。对得到的滤液定容，然后分别测定不同酶量提取条件下有效成分的含量以及出膏率，并进行多指标综合评分。结果酶用量为0.5% ，1% ，2% ，3% ，4% ，5% 时，综合评分分别为 76.182 32，81.482 60，85.927 43，89.284 68，84.128 45，80.928 46。可见，提取酶量为3%时已达最佳效果。

2.3.3 正交试验设计

精密称取3年生毛脉酸模叶粉末0.503 2 g，对影响提取效果的主要因素酶解时间(因素A)、酶解温度(因素B)、pH(因素C)进行正交试验。因素水平见表6。按L9(34)正交试验表分别制备各样品溶液，滤过，蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至25 mL，用微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。分别吸取上述各供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定各指标成分含量和出膏率，并进行多指标综合评分，结果见表7，方差分析见表8。由方差分析可知，酶解时间对结果影响显著，酶解温度和pH对结果影响不显著。结合直观分析，选定最佳提取条件为A2B3C3，即酶解时间90 min，酶解温度60℃，pH=6。

表6 复合酶法因素水平表

表7 复合酶法正交试验结果(n=3)

表8 复合酶法方差分析表

2.3.4 验证试验

对筛选出的最佳工艺A2B3C3进行验证试验。结果白藜芦醇苷含量为0.248 2%，白藜芦醇含量为0.065 27%，大黄素含量为0.132 2%，浸膏得率为28.97%(n=3)，表明工艺达到了优化目的。

2.4 原生质体提取法正交试验

2.4.1 提取条件优化

先采用单因素试验，对纤维素酶用量、果胶酶用量、酶解时间、酶液渗透压进行研究，分别测定原生质体提取产量。在此基础上，选取主要影响因素和合适的水平，按L9(34)正交试验表的条件进行试验，并作多指标综合评分(评分方法同索氏提取法)，以确定毛脉酸模叶提取的最佳条件。

2.4.2 单因素试验

纤维素酶用量:精密称取毛脉酸模新鲜叶片0.500 0 g，在温度为25℃、pH为5.6、渗透压为0.5 mol/L的条件下，每克药材加0.3%的果胶酶，在不同纤维素酶用量的处理条件下取样检测原生质体的提取情况。结果纤维素酶用量为 0.3%，0.5%，1.0%，1.5% ，2.0% 时，原生质体产量分别为 1.2 ×106，4.3 ×106，4.8 ×106，4.1 ×106，3.1 ×106个 /mL。因此，纤维素酶的最佳用量为 1%，其次为0.5%和1.5%，故选这3个水平进行正交试验。

果胶酶用量:精密称取毛脉酸模新鲜叶片0.500 0 g，在温度为25℃、pH为5.6、酶液渗透压为0.5 mol/L的条件下，每克药材加1%的纤维素酶，在不同果胶酶用量的处理条件下取样检测原生质体的提取情况。结果果胶酶用量为 0.05%，0.1%，0.3%，0.5%，1.0% 时，原生质体产量分别为 1.4 ×106，3.2 ×106，3.7 ×106，3.4 ×106，2.9 ×106个 /mL。因此，果胶酶的最佳用量为 0.3% ，其次为0.1%和0.5%，故选这3个水平进行正交试验。

酶解时间:精密称取毛脉酸模新鲜叶片0.500 0 g，在温度为25℃、pH为5.6、渗透压为0.5 mol/L的条件下，每克药材加1%的纤维素酶和0.3%的果胶酶，在不同时间取样检测原生质体的提取情况。结果酶解时间为 1，2，3，4，5 h 时，原生质体产量分别为 2.1 ×106，2.4 ×106，2.6 × 106，2.5 ×106，2.3 × 106个 /mL。因此，最佳酶解时间为3 h，其次为2 h和4 h，故选取这3个水平进行正交试验。

渗透压:精密称取毛脉酸模新鲜叶片0.500 0 g，在温度为25℃、pH为5.6的条件下，每克药材加1%的纤维素酶和0.3%的果胶酶，在不同渗透压下取样检测原生质体的提取情况。结果渗透压为0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mol/L 时，原生质体产量分别为 2.0 ×106，2.4 ×106，2.7 ×106，2.6 ×106，2.2 ×106个 /mL。因此，最佳渗透压为 0.5 mol/L，其次为 0.4 mol/L 和 0.6 mol/L，故选择这 3 个水平进行正交试验。

2.4.3 正交试验设计

精密称取3年生毛脉酸模新鲜叶片2.800 g，对影响提取效果的主要因素纤维素酶用量(因素A)、果胶酶用量(因素B)、酶解时间(因素C)、渗透压(因素D)进行正交试验。因素水平见表9。按L9(34)正交试验表分别制备各样品液，滤过，蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至25 mL，用微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。分别吸取上述各供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定各指标成分含量以及出膏率，并进行多指标综合评分，结果见表10，方差分析见表11。方差分析结果表明，果胶酶用量对结果影响显著，其他因素对结果影响不显著。结合直观分析，选定最佳提取条件为A1B2C2D3，即纤维素酶1.0%，果胶酶0.5%，渗透压0.5 mol/L，酶解时间 2 h。

表9 原生质体提取法因素水平表

表10 原生质体提取法正交试验结果及其数据处理表(n=3)

表11 原生质体提取法方差分析表

2.4.4 验证试验

对筛选出的最佳工艺A1B2C2D3进行验证试验。结果白藜芦醇苷含量为0.278 8%，白藜芦醇含量为0.098 15%，大黄素含量为0.138 6%，浸膏得率为26.32%(n=3)，表明工艺达到了优化目的。

3 讨论

采用多指标综合评分方法对3种不同提取方法的最优工艺进行综合评分(评分方法相同)，结果传统索氏提取法最佳提取工艺的得分为35.59，复合酶法最佳提取工艺的得分为86.41，原生质体提取法最佳提取工艺的得分为92.17。表明用原生质体提取法，有效成分的得率较高，同时实现了白藜芦醇苷到白藜芦醇的转化，转化效率也较高。试验证明此法在提取毛脉酸模叶片有效成分方面是可行的，但是否适用于所有叶类药材尚需试验进一步证明。原生质体提取法为叶类药材有效成分的提取提供了一种思路。用复合酶法提取毛脉酸模叶中有效成分时，得率要低于原生质体提取法，但操作相对简单，有效成分的得率要高于传统索氏提取法。

[1]吉林省中医中药研究所.长白山植物药志[M].吉林:吉林人民出版社，1982:299.

[2]朱至清.植物细胞工程[M].北京:化学工业出版社，2003:152.

[3]张 彤，徐莲英，陶建生，等.多指标综合评分法优选葛根提取工艺[J].中草药，2004，35(1):38－40.

[4]李元波.复合酶解法提取三七皂苷的实验研究[J].天然产物研究与开发，2005，17(4):488－492.

[5]张庆增.复合酶法提取当归多糖及其生物活性研究[D].吉林:吉林大学，2006.

Comparative Study on the Extracting Methods for Effective Components in Leaf of Rumex Gmelini

Wang Zhenyue1， Liu Yingxin1，2，Liu Lili2
(1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang，China 150040;2.Hunan Traditional Chinese Medical College，Zhuzhou，Hunan，China 412012)

Objective To compare the diffirent extracting methods on effective components in leaf of Rumex gmelini.Methods Use resveratrol glucoside，resveratrol，emodin and paste－forming rate as the indictator，adopt orthogonal design testing and multiple guidelines grading method to compare three methods.Results The grade of the best extraction technology of the traditional soxhlet extraction method was 35.59;compound enzyme method was 86.41;the method of extracting protoplast was 92.17.Conclusion The method of extracting protoplast is better than the other two methods.

Rumex gmelini Turcz.;extracting methods;best extraction technology

TQ461;R282.71

A

1006－4931(2011)09－0004－04

2010－09－01;

2010－12－20)

＊国家自然科学基金项目，项目编号:30970300，30270156。

王振月(1956－)，男，黑龙江哈尔滨人，教授，硕士研究生导师，主要从事中药资源开发与生物技术研究工作，(电话)0451－82196254(电子信箱)wangzhen_yue@163.com。