小鼠胚胎附植前后瘦素长型受体在下丘脑及消化器官的表达

邓艳幔，崔亚利，胡 满，肖 欢

(河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000)

小鼠胚胎附植前后瘦素长型受体在下丘脑及消化器官的表达

邓艳幔，崔亚利，胡 满，肖 欢

(河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000)

目的 对长型瘦素受体在雌性昆明鼠生殖周期中的表达情况进行研究。方法 采用蛋白免疫印迹实验方法对下丘脑、胃、十二指肠组织中的瘦素受体进行了分析，并用免疫组织化学染色法对雌性KM鼠生殖周期不同阶段的下丘脑、胃、十二指肠组织中表达的瘦素长型受体进行定位分析。结果与结论 瘦素受体六个亚型的分子量大约分别为(120、90、77、66.2、54、47)×103;下丘脑神经元胞质中有棕褐色阳性颗粒，且数目随妊娠日龄增加而增加;胃底腺中下部分胞质和细胞核有棕褐色阳性颗粒，且阳性率随妊娠日龄的增加而增加;十二指肠腺中胞质和细胞核有棕褐色阳性颗粒，且阳性率随妊娠日龄的增加而增加。

瘦素;瘦素长型受体;蛋白免疫印迹;免疫组织化学;小鼠

本实验基于近年来的研究成果，以KM鼠为对象检测其生殖周期中下丘脑、胃肠组织六个不同时期瘦素受体随生殖周期的变化情况。目的是对下丘脑、胃肠组织中瘦素长型受体蛋白随生殖周期的变化规律进行研究，为进一步研究瘦素在动物胚胎附植前后如何调节机体能量平衡奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

KM鼠，清洁级，体质量20～25 g，60只雌性和5只雄性，来源于北京大学医学部【SYXK(京)2006-0008】。饲养于清洁级小鼠动物房内，温度18～25℃，相对湿度50% ～60%，光照明暗各12 h，通风10次/小时，每笼5～6只，自由摄食与饮水。喂饲全价营养颗粒饲料，动物饮水为城市自来水用净水器过滤后装入消毒过的饮水瓶内自由饮用。

1.2 实验动物分组和取材

雌性KM鼠共60只分为6组，每组10只，每组选5只理想模型小鼠取材。分别按间情期、发情期、妊娠4日龄、妊娠5日龄、妊娠7日龄、妊娠9日龄的KM鼠脱臼处死，取每个小鼠脑、胃、十二指肠均分为两份，分别置于4%多聚甲醛和-20℃冷冻保存，备用。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白免疫印迹实验

(1)材料：免疫印迹增强化学发光ECM显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，批号：EK1002;兔抗小鼠瘦素受体一抗购自武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1234;醋酸纤维薄膜购自武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR0135。

(2)操作过程：小鼠下丘脑、胃、肠等组织裂解，配胶，制备小鼠组织免疫蛋白印迹上样液，点样，跑电泳，转膜，TBST洗膜(10 min×3)次，用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜(10 min×3)，小鼠瘦素受体一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜(10 min×3)次，羊抗兔二抗孵育2h，TBST洗膜(10 min×3)，ECM显色，曝光X线片，扫描X线片。

1.3.2 免疫组织化学染色

(1)材料：兔抗小鼠长型瘦素受体一抗购自武汉博士德生物工程有限公司，羊抗兔二抗免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司，浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司，货号：375230AJ。

(2)实验过程：①常规石蜡切片、脱蜡、水化，PBS(pH 7.4)冲洗(5 min×3次);②滴加过氧化酶阻断溶液(试剂A)，作用10 min，PBS冲洗(5 min×3次);③加入绵羊工作液(试剂B)，作用30 min;④滴加兔抗小鼠瘦素抗体(4℃过夜)，PBS冲洗(5 min×3次);⑤滴加生物素标记的羊抗兔二抗(试剂C)，37℃孵育35 min;⑥滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂 D)，37℃孵育40 min;⑦DAB显色，显微镜控制，一般10～15 min，PBS冲洗10 min，蒸馏水冲洗10 min;⑧苏木素复染，冲洗，脱水，透明，中性树胶封固，镜检。显微镜观察，阳性产物呈棕褐色，阴性对照组则无棕黄色颗粒。阴性对照组用PBS代替一抗，其余步骤同上。

1.4 数据处理

KM鼠下丘脑免疫组织化学染色ob-Rb阳性神经元采取每个切片取五个视野按照取上不取下，取左不取右的原则计数;以上数据用SPSS11.0软件的one way ANOVA方法进行显著性检验，用Duncan多重比较组间差异，P＜0.05为差异有显著性，实验结果用均数±标准差(¯x±s)表示。

2 结果

2.1 蛋白免疫印迹结果

小鼠下丘脑、胃、十二指肠经蛋白免疫印迹实验均有六条蛋白条带，且蛋白质条带分子量的大小经标准预染 marker比对发现其分子量大约为(120、90、77、66.2、54、47) ×103(见图 1)。

2.2 免疫组化染色结果

2.2.1 小鼠下丘脑免疫组化染色结果：经免疫组化SP法染色，ob-Rb免疫反应阳性神经元呈深浅不等的棕褐色，胞体大小不一。有的胞质呈深褐色，颗粒界限不清楚，有的可见棕黄色的阳性颗粒，经苏木素复染后细胞核成蓝色(图2，彩插6)。6个阶段 KM鼠每组取5只小鼠的下丘脑，每个组织按照隔三取一的原则选择5张切片，每张切片在400倍下选择5个视野，对每个视野内的阳性细胞进行计数，结果见表1。

从表1可见，妊娠期比间情期阳性细胞明显增多，差异有显著性(P＜0.05)。妊娠9日龄小鼠 ob-Rb表达量最多，与其他组差异有显著性(P＜0.05)。

图1 胃、下丘脑、十二指肠蛋白免疫印迹结果Fig.1 The results of Western blot analysis of the hypothalamus，stomach and duodenum

表1 下丘脑ob-Rb免疫组化染色计数结果(n=25)Tab.1 The counting results of immunohistochemical staining of the hypothalamus ob-Rb in mice(n=25)

2.2.2 小鼠胃免疫组织化学染色结果：由图3(彩插6)可见，在小鼠胃底腺中免疫组化染色呈棕黄色，阳性细胞主要位于胃腺的体部和底部，通过苏木素复染发现阳性细胞主要为胃壁细胞，少量主细胞，有的阳性细胞仅胞质内免疫组化染色呈棕黄色，有的细胞核内有棕黄色阳性显色，有些细胞胞质、胞核内都有棕黄色阳性显色;妊娠4日龄阳性细胞较间情期明显增多;妊娠7日龄胃腺免疫组化染色棕黄色阳性颗粒比间情期、妊娠4日龄明显增多，第9日龄胃底腺棕黄色阳性颗粒多且染色较深。

2.2.3 小鼠十二指肠免疫组织化学染色结果：由图4(彩插7)可见，小鼠不同生殖阶段十二指肠肠绒毛和肠腺免疫组化染色均有棕黄色阳性颗粒，十二指肠腺细胞质与细胞核均有棕黄色阳性颗粒，十二指肠柱状上皮细胞胞质和胞核有少量棕黄色颗粒。妊娠4日龄十二指肠肠绒毛棕黄色阳性颗粒明显多于间情期，妊娠7日龄小鼠的十二指肠肠绒毛和十二指肠腺，棕黄色阳性颗粒明显高于间情期、妊娠4日龄小鼠相同组织。

3 讨论

3.1 ob-Rb瘦素受体蛋白免疫印迹分析

瘦素受体是一个单次跨膜的受体，以单氨基酸开始，其前22个氨基酸是一个典型的疏水信号肽，胞外区为816个氨基酸，其后紧跟着跨膜区为23个氨基酸，胞内区则长短不一。Borja等［3］用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹实验证实ob-Rb蛋白的分子量为120×103。本实验结果表明，在小鼠的下丘脑、胃肠中存在六种瘦素受体，其分子量分别大约为(120、90、77、66.2、54、47) × 103，这与报道中的小鼠体内有6种瘦素受体一致。根据国内外的相关报道，本研究认为分子量为120×103的条带为ob-Rb。

3.2 ob-Rb在下丘脑的表达

瘦素受体广泛存在于中枢神经系统和外周组织中，其中功能型瘦素受体ob-Rb主要在下丘脑表达，可介导瘦素的细胞内作用［4］，Ladyman 等［5］报道在妊娠大鼠下丘脑ob-Rb的表达对于瘦素调节能量平衡起到重要的作用。有报道瘦素的作用方式有两种：短程调控作用包括对进食作出反应的饱食信号和脑干的迷走神经将信号输入到中枢的介导作用;长程调控作用包括对来自脂肪细胞的信号和神经肽的介导作用。

Seeber等［6］实验发现下丘脑编码的 ob-Rb mRNA表达在孕早期增加，孕中期降至孕前水平，之后维持稳定。本实验研究证明，ob-Rb蛋白质在下丘脑中有表达，而且下丘脑ob-Rb随小鼠妊娠日龄增加表达量也逐渐增加至妊娠9日龄，与以上研究结果相似。下丘脑是调节能量动态平衡、食欲和繁殖的中枢神经系统关键部位。妊娠期母体代谢平衡发生变化，瘦素受体表达量逐渐增加可能是一种妊娠期母体通过中枢神经间接调控代谢平衡的机制。瘦素可能作为代谢信号，通过与其受体结合，向下丘脑传递脂肪沉积的信息，进而连接体内的营养状况和繁殖机能。

3.3 ob-Rb在胃肠内的表达

姚红等［7］用原位杂交证明ob-R mRNA阳性细胞位于中下部胃腺细胞胞质内。章孝荣等［8］的实验表明，长型瘦素受体mRNA在大鼠胃和十二指肠黏膜和黏膜下层广泛表达。Mix等［9］在胃镜下活检的胃底胃窦黏膜、原代培养的人胃上皮细胞和人胃癌细胞株AGS均可检测到瘦素、瘦素长型受体和3种短受体、瘦素mRNA的表达，免疫组化显示在胃腺的中下部分均存在对瘦素及其长型受体反应阳性的细胞，应用针对壁细胞和主细胞特异性抗体的荧光免疫双重标志技术，证实这些细胞为壁细胞和主细胞。与以上研究一致，本实验对胃免疫反应阳性细胞进行苏木素复染后观察，胃腺中呈ob-Rb免疫反应阳性的细胞多数是壁细胞，少数为主细胞或内分泌细胞。瘦素长型受体存在于胃底腺的下半部。此外，瘦素长型受体在细胞核上也呈阳性结果。分析原因认为，瘦素受体信号转导的主要途径是JAKSATA。瘦素与其受体结合后，使受体形成二聚体，与受体偶联的JAK分子相互靠近并出现交互磷酸化，活化JAK激酶，使受体胞内域的氨酸残基磷酸化，受体通过磷酸化的氨酸与特定的STAT分子上SH2结构域的精氨酸和Tyr-P形成同源或异源二聚体，二聚体从胞质转位入核与靶基因的启动子结合，激活相应基因的转录和表达而发挥作用。二聚体形式的长型瘦素受体其胞外结构域的氨基酸结构没有改变，仍可结合抗体，故免疫组织化学染色细胞核也呈阳性反应。而有研究报道认为瘦素长型受体是跨细胞膜受体，只存在于胞质中。

本实验证实ob-Rb在胚胎附植后在胃内壁细胞的阳性结果明显强于间情期胃壁细胞，Goiot(2001)［10］指出，经外周途径投予瘦素可增加胃的基础酸分泌和黏膜内胃泌素mRNA。分析原因可能为胃壁细胞主要功能是合成和分泌盐酸，推测胚胎附植后胃ob-Rb在壁细胞表达增多，与瘦素结合后有促进胃酸分泌的作用。胃酸分泌增多，一方面能够激活更多的胃蛋白酶原，促进蛋白质的消化有利于机体吸收，另一方面胃酸的增多能够抵御更多食源性微生物感染，从而起到杀菌消毒的目的。此外，少量主细胞也呈阳性，可能ob-Rb对胃蛋白酶原的分泌有促进作用。

Pealson等［11］对SD大鼠研究证实，在大段小肠切除术后，给予外源性瘦素，可使半乳糖的吸收提高44%，果糖转运体的强度提高14%，但对DNA含量和葡萄糖一钠转运体强度无影响，瘦素可增加小肠对糖的吸收。有研究证明瘦素能够促进小肠的消化吸收，本实验证明，瘦素长型受体主要存在于十二指肠腺，其次为肠绒毛的柱状上皮细胞中。胚胎附植后十二指肠吸收细胞胞质和胞核免疫组化阳性结果明显强于间情期，认为由于母体能量需要，在胚胎附植后，瘦素与增多的长型受体结合后，受体的二聚体进入胞核能够促进多种消化酶类的转录，促进小肠液的分泌，大量的小肠液有利于消化吸收。推测：十二指肠肠绒毛柱状上皮细胞中ob-Rb在胚胎附植后表达量明显增加，能促进柱状上皮细胞的吸收，其机理有待于进一步研究。

(本文图2，3见彩插6，图4见彩插7。)

［1］ Zhang Y，Proence R，Maffei M，et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue［J］.Nature，1994，372(6505)：425-432.

［2 ］ Soderberg S，Ahren B，Stegmayr B，et al.Leptin is a risk marker for first-ever hemorrhagic stroke in a population-based cohort［J］.Stroke，1999，30(2)：328-337.

［3 ］ Guerra B，Fuentes T，Delgado-Guerra，et al.Gender dimorphism in skeletal muscle leptin receptors，serum leptin and insulin sensitivity［J］.Plos one，2008，3(10)：1-8.

［4］ Harigaya A，Nagashima K，Nako Y，et al.Relationship between concentration of serum leptin and fetal growth［J］.Clin Endocinol Metab，1997，82：3281-3284.

［5］ Ladyman SR，Grattan DR.Suppression of leptin receptor messenger ribonucleic acid and leptin responsiveness in the ventromedial nucleus of the hypothalamus during pregnancy in the rat［J］.Endocrinology 2005，146(9)：3868-3874.

［6］ Seeber RM，Smith JT，Waddell BJ.Plasma leptin binding activity and hypothalamic leptin receptor expression during pregnancy and lactation in the rat［J］.Biol Reprod，2002，66(6)：1762-1767.

［7］ 姚红，郝素珍，原素梅，等.胃黏膜瘦素和瘦素受体的表达及信号转导［J］. 山西医科大学学报，2004，35(2)：122-125.

［8］ 章孝荣，刘国庆，申国明.长型Leptin(瘦素)受体mRNA在大鼠消化道中的表达［J］.安徽农业大学学报，2002，9(3)：276-278.

［9］ Mix H，Widjaja A，Jandl O，et al.Expression of leptin and leptin receptor isoforms in the human stomach［J］.Gut，2000，47(4)：481-486.

［10］ Goiot H，Attoub S，Kermorgant S，et al.Antral mucosa expresses functional leptin receptors coupled to STAT-3 signaling，which is involved in the control of gastric secretions in the rat.Gastrocnterology，2001，121(6)：1417-1427.

［11］ Pearson PY，Connor DM，Sehwartz MZ，et al.Novel effect of leptin on small intestine adaptation［J］.J Surg Res，2001，97(2)：192-195.

Expression of long-leptin receptor in the hypothalamus and digestive organs of the female mice pre-and post-embryo implantation

DENG Yan-man，CUI Ya-li，HU Man，XIAO Huan
(College of Animal Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China)

Objective To study the expression of long-leptin receptors in the hypothalamus and the digestive organs in the female KM mice at different stages of reproductive cycle.Methods The expression of long-leptin receptors in the hypothalamus and the digestive organs in female mice at different stages of reproductive cycle was determined by Western blot and immunohistochemical staining.Results The molecular weight of the six bands of leptin receptor isoforms were about(120，90，77，66.2，54 and 47) ×103.There were many cytoplasmic positive brown particles in the neurons of hypothalamus，and the tan-positive cells increased with pregnant days.In the lower part of the stomach fundic glands，there were more positive brown particles in the cytoplasm and nucleus in pregnant mice than that of the diestrus mice.In duodenal glands，there were more positive brown particles in the cytoplasm and nucleus in pregnant mice than that in the diestrus mice.

Leptin;Long-leptin receptor;Western blot;Immunohistochemistry;Mice

Q95-33，S852.16

A

1005-4847(2011)01-0065-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.015

瘦素(leptin)是肥胖基因(obese gene)的表达产物，是由脂肪组织(特别是白色脂肪组织)分泌的一种多肽循环激素［1］，早期研究认为瘦素能够调节摄食和能量代谢平衡。瘦素受体广泛存在于中枢神经系统和外周组织中，且在结构上与白介素2、6和GH等细胞因子受体结构相似，参与胎儿器官的发育［2］。1969年，Coleman等进行了一系列小鼠联体共生实验：db/db小鼠与正常小鼠相连，db/db小鼠依然肥胖，而正常小鼠饥饿死亡。db/db小鼠与ob/ob小鼠相连，ob/ob小鼠进食少，饥饿致死，而 db/db小鼠依然肥胖。ob/ob小鼠与正常小鼠相连，ob/ob小鼠进食减少，体重减轻，而正常小鼠并无变化。这与瘦素及瘦素受体的作用是极其相符合的。db/db小鼠分泌大量的瘦素，抑制了与它相联体的正常小鼠或ob/ob小鼠的食欲，使正常小鼠和ob/ob小鼠饥饿死亡，而db/db自身由于有受体缺陷，对自身超量的瘦素并没有反应.正常小鼠分泌一定的瘦素可使与它联体而又缺少瘦素的小鼠体重减轻。ob/ob小鼠没有瘦素的分泌，对正常小鼠无作用。这个实验验证了瘦素及瘦素受体能够对小鼠的摄食进行调控，可以对机体的能量平衡进行调节。瘦素与瘦素受体结合，主要通过 JAK-STAT通路发挥复杂的生理作用，迄今为止人们发现小鼠瘦素受体有a、b、c、d、e和 f六种亚型，其中只有长型受体(ob-Rb)在体内外有激活信号转导和转录作用，是重要的功能受体。

河北省教育厅资助项目(2006119);河北农业大学博士基金。

邓艳幔(1983-)，女，河北保定人，硕士，研究方向：组织胚胎学和机能形态学。E-mail：DYM66@yahoo.cn

崔亚利(1970-)，女，河北保定人，副教授，主要从事组织胚胎学和机能形态学教学研究工作。E-mail：cuiyalidk@hebau.edu.cn。电话：0312-7528472

2010-04-07