不同蛋白质含量的同品种大麦中热稳定蛋白质及泡沫蛋白质的变化

陈 霞, 莫 新 迎, 韩 丹, 姜 晓 雷, 李 明 达, 赵 长 新

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

大麦是啤酒生产的重要原料,而蛋白质含量是大麦质量的关键指标之一。大麦蛋白质含量的高低及类型,直接影响制麦和酿造工艺及啤酒的质量。大麦中在经历发芽、糖化以及煮沸发酵等一系列酿造过程后活性仍然能够得以保存[1-2]的蛋白质成为热稳定蛋白质,其中能够促进啤酒泡沫生成并增强啤酒泡沫稳定性的蛋白质称为泡沫蛋白质,这两种蛋白质成为决定啤酒口感风味、泡沫及胶体稳定性等品质指标[3]。大麦热稳定蛋白质分为热稳定性水溶蛋白质(清蛋白质)、热稳定性盐溶蛋白质(球蛋白质)、热稳定性醇溶蛋白质(醇溶蛋白质)和热稳定性碱溶蛋白质(谷蛋白质)。其中大麦中重要的泡沫蛋白质是蛋白质Z和LTP蛋白,蛋白质Z占水溶蛋白质总量的5%左右,能够增强泡沫的稳定性与啤酒的非生物稳定性[4],LTP是小分子球蛋白质,分子质量约10 ku。热稳定蛋白质在酿造过程中分子的大小和构象上发生了改变,促使其泡沫活性也发生了变化[5],因此对大麦及啤酒中热稳定蛋白质的研究越来越多并受到广泛的关注[6]。

用于酿造的大麦的蛋白质质量分数范围为9.0%～12.0%。作者以不同蛋白质含量的酿造大麦(甘啤三号,其总蛋白质质量分数依次为9.4%、10.8%和11.5%)为研究对象,利用Bradford法和SDS-PAGE电泳技术对其热稳定蛋白质组成及含量与发芽过程中泡沫蛋白质含量及组成变化进行分析,以期为评估大麦以及预测麦芽质量和啤酒泡沫的品质提供借鉴与参考。

1 实 验

1.1 材料与试剂

甘啤三号(蛋白质质量分数9.4%),甘啤三号(蛋白质质量分数10.8%),甘啤三号(蛋白质质量分数11.5%),由大连中粮麦芽有限公司提供。

试剂:SDS-PAGE低分子质量蛋白质标准,上海凯博生物技术有限公司;考马斯亮蓝G250/R250;甘氨酸,Amresco;牛血清白蛋白质; DTT,Merk;丙烯酰胺;EDTA·Na2,Sigma;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ZPS-250 H智能恒温恒湿培养箱,黑龙江东拓仪器制造有限公司;pH计,Mettler-Toledo Delta320;Unic-7200分光光度计,上海尤尼柯仪器有限公司;JM-250型小型电泳仪,大连捷迈科贸有限公司;低速离心机LD4-2 A,北京医用离心机厂;YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器,上海三申医疗器材有限公司;蛋白质测定仪 KDN-05A,上海贝特仪电设备厂。

1.3 方 法

1.3.1 蛋白质的提取

1.3.1.1 热稳定蛋白质的提取

(1)准确称取粉碎后的大麦1 g(扣除水分后的绝干质量),加入去离子水5 mL,摇匀;(2)60 ℃水浴中提取2 h,每10 min摇1次;(3)2 800g离心15 min,保留上清液作为水溶蛋白质;(4)在沉淀中再添加质量分数5%的NaCl溶液5 mL,过程同步骤(2),上清液为盐溶蛋白质;(5)在沉淀中再添加体积分数为70%乙醇(含少量巯基乙醇)溶液5 mL,过程同步骤(2),获得醇溶蛋白质;(6)剩余的沉淀中添加质量分数0.2% NaOH溶液5 mL,过程同步骤(2),获得碱溶蛋白质;(7)将上述4种蛋白质粗提液于沸水中水浴20 min,2 800g离心15 min,所得上清液为大麦热稳定蛋白质提取液[7]。

1.3.1.2 泡沫蛋白质的提取

准确称取大麦1 g (粉碎后扣除水分后的绝干质量),加入4 ℃提取液(NaCl 10 mmol/L,Tris-Cl 50 mmol/L,EDTA·Na21 mmol/L,DTT 1 mmol/L,pH 7.5) 5 mL,摇匀,置4 ℃浸提取2 h,每隔10 min摇一次。2 800g离心15 min,得上清液为泡沫蛋白质粗提液。将此泡沫蛋白的粗提液于沸水中水浴20 min,2 800g离心10 min,所得上清液为泡沫蛋白质提取液[7]。

1.3.2 蛋白质含量测定

实验采用Bradford法,牛血清白蛋白质作为标准蛋白质。分别配制质量浓度为0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL的牛血清蛋白质溶液,做两组平行实验。实验步骤如下:从配置好的不同质量浓度的牛血清蛋白质溶液中分别取0.1 mL,分别加入5 mL考马斯亮蓝工作液,摇匀后静置5 min,于A595nm处测吸光值。计算平行试验数据的平均值作图[7]。

1.3.3 SDS-PAGE

在Laemmli不连续系统、4 ℃环境下进行电泳,分离胶质量分数为12% (80 mm×80 mm×1 mm),浓缩胶质量分数为5%(80 mm×8 mm×1 mm)。考马斯亮蓝R250对凝胶进行染色,用脱色摇床对凝胶脱色至背景透明后拍照[7]。

2 结果与讨论

2.1 大麦中热稳定蛋白质的变化

2.1.1 热稳定蛋白质含量变化

从图1看出,大麦中的热稳定蛋白质与大麦含有的总蛋白质含量呈正相关关系,蛋白质质量分数最高的11.5%甘啤三号所含的热稳定蛋白质始终最高。大麦间蛋白质的差异有可能来自蛋白质对溶解液的溶解性以及高温对蛋白质作用的影响。图1中大麦中热稳定性醇溶蛋白质含量相对其他热稳定性蛋白质最高,其次是热稳定性盐溶蛋白质,大麦热稳定性碱溶蛋白质含量最低。

图1 不同蛋白质质量分数大麦中热稳定性蛋白质质量分数

大麦蛋白质含量的高低及类型,直接影响制麦和酿造工艺及啤酒的质量,品种相同的大麦在蛋白质含量上也是存在差别的,大麦中不同蛋白质的分布因大麦总氮的变化而变。实验证明,大麦中的蛋白质经过高温煮沸其结构发生了相应的变化,使得结构更加稳定。例如斯克里邦(Scriban 1953)证明,水溶蛋白质可以分为B1和B2组,B1组于煮沸时凝固沉淀,它可能是与多糖结合的物质,对啤酒泡沫起重要作用,它存在于β-淀粉酶中。作为贮存蛋白质尤其是大麦醇溶蛋白质随总氮的增加而明显增加,其质量分数可以在36%～49%变化,并与大麦品种的特性相关,高赖氨酸大麦突变品种的醇溶蛋白质随总氮的增加与其他蛋白质的变化同比例,而其他蛋白质只有少量的增加。从图1中可以看出大麦中热稳定蛋白质含量变化也遵循这一规律,与大麦中蛋白质含量变化情况基本相同。

2.1.2 大麦热稳定蛋白质SDS-PAGE图谱分析

从图2、3不同蛋白质含量大麦热稳定蛋白质电泳图谱可以看出,3个大麦总蛋白质虽然不同但热稳定蛋白质组成基本相同。热稳定性水溶蛋白质主要由分子质量约40 与5～15 ku两部分组成,热稳定性盐溶蛋白质分子质量主要集中在72、57、40与5～23 ku四部分,热稳定性醇溶蛋白质分子质量主要集中在94、60、29～54与5～15 ku 四部分,热稳定性碱溶蛋白质分子质量主要集中在94、60、50、40与5～23 ku五部分。

2.2 大麦发芽过程中泡沫蛋白质的变化

2.2.1 大麦发芽过程中泡沫蛋白质含量的变化

由Bradford法测定高蛋白质含量与低蛋白质含量的两种大麦发芽各阶段泡沫蛋白质含量结果(图4)可见:高蛋白质含量大麦中泡沫蛋白质质量分数(3.25 mg/g)高于低蛋白质含量的大麦(2.95 mg/g),在浸麦阶段(0～24 h),泡沫蛋白质的含量急剧下降,之后呈逐渐上升的趋势。由于提取液中的泡沫蛋白质主要来自大麦糊粉层,浸麦(0～24 h)阶段一部分作为贮藏蛋白质在发芽初期被水解,含量迅速下降,并为种子的生长提供营养;其他一些泡沫蛋白质为种子在休眠期间抵御恶劣环境而以此稳定结构形式存在。在整个发芽过程中,两种大麦的泡沫蛋白质含量的变化基本相同,且高蛋白质含量大麦的泡沫蛋白质高于低蛋白质含量大麦。

1～3,不同蛋白质含量大麦热稳定性水溶蛋白质;4～6,不同蛋白质含量大麦热稳定性盐溶蛋白质

1～3,不同蛋白质含量大麦热稳定性醇溶蛋白质;4～6,不同蛋白质含量大麦热稳定性碱溶蛋白质

图4 不同蛋白质含量大麦发芽过程中泡沫蛋白质质量分数变化

2.2.2 大麦发芽过程中泡沫蛋白质SDS-PAGE图谱分析

从泡沫蛋白质的SDS-PAGE图谱中观察到:发芽24 h泳道条带数目较原大麦的蛋白条带数量明显减少、且颜色淡,说明泡沫蛋白质的种类和含量均有所减少,这可能是受到部分蛋白酶水解作用或某些酶原的修饰,从而蛋白质的结构发生构象变化不再耐热,在热处理时发生絮凝,产生沉淀。发芽阶段(48～120 h)泳道颜色逐渐加深,与Bradford法测定的泡沫蛋白质含量的变化一致。

电泳图谱(图5)中40 ku左右的条带为蛋白质Z;10 ku左右的条带主要为LTP(磷脂转移蛋白质,重要的啤酒泡沫蛋白质)。在大麦萌发过程中,蛋白质Z含量不断增加。在整个大麦发芽过程中泡沫蛋白质分子质量主要集中在40 ku左右与5.0～20.0 ku两部分。从图5中对比发现,两个大麦在萌发过程中泡沫蛋白质的组成与变化基本相同。因此大麦发芽过程中的泡沫蛋白质的组成和相对含量,可以用来指示和预测其所制成的啤酒泡沫稳定性及持泡性,从而预测啤酒品质,并进而通过对大麦发芽过程中的影响因素的改进来提升啤酒质量和价值。

(a) 蛋白质质量分数9.4%的大麦

(b) 蛋白质质量分数11.5%的大麦

3 结 论

考察了同品种不同蛋白质含量的3种大麦中热稳定蛋白质含量及其组成,发现大麦中热稳定蛋白质含量与大麦总蛋白质含量呈正相关,大麦间热稳定醇溶蛋白质含量差别最大且含量最高;虽然热稳定蛋白质含量不同但其组成基本相同。热稳定性水溶蛋白质主要由分子质量约40与5～15 ku两部分组成,热稳定性盐溶蛋白质分子质量主要集中在72、57、40与5～23 ku四部分,热稳定性醇溶蛋白质分子质量主要集中在94、60、29～54与5～15 ku四部分,热稳定性碱溶蛋白质分子质量主要集中在94、60、50、40与5～23 ku五部分。

对低蛋白质含量与高蛋白质含量大麦发芽过程中泡沫蛋白质的含量及组成的变化情况进行测定与分析,结果显示高蛋白质含量大麦中的泡沫蛋白质含量略高于低蛋白质含量的大麦。在整个大麦萌发过程中,两个大麦的泡沫蛋白质含量的变化及组分基本相同,且高蛋白质含量大麦的泡沫蛋白质高于低蛋白质含量大麦。

大麦热稳定性蛋白质及泡沫蛋白质组分在大麦总氮的变化过程中无明显的变化,但其热稳定蛋白质和泡沫蛋白质的含量与大麦中总氮呈正相关,这为进一步考察不同品种相同蛋白质含量大麦中热稳定蛋白质的变化规律奠定了基础,为评价和预测麦芽和啤酒泡沫的品质特性提供借鉴。

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