HPLC测定防凤中色原酮的含量

陈桂玉1，郭洪丽2，项东宇1*

（1.山东中医药高等专科学校，山东 烟台 26410 0；2.吉林省白山市食品药品检验所，吉林 白山 13430 0）

HPLC测定防凤中色原酮的含量

陈桂玉1，郭洪丽2，项东宇1*

（1.山东中医药高等专科学校，山东 烟台 26410 0；2.吉林省白山市食品药品检验所，吉林 白山 13430 0）

目的：建立高效液相法测定防风中4种色原酮的方法。方法：采用DiamonsilC18（4.6mm×200mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇－水梯度洗脱（甲醇：0～15min，20%～45%；15～25m i n，45%～70%）；流速1m L·min－1。柱温30℃；波长254nm。结果：升麻素苷在0.15～3μ g、升麻素在0.0 2～0.4μ g、5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.25～5μ g、亥茅酚苷在0.0 1～0.2μ g线性关系良好。结论该方法快速简便，准确可靠，可用于防风中4种色原酮的测定。

防风；微波提取；色原酮

防风Saposhni kovia div aricata（Turcz.）Schischk.为伞形科防风属多年生草本植物，现收载于 《中国药典》2010年版一部，以未抽薹的干燥根入药，是我国重要的药用植物。具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功能［1］。现代药理研究其主要的活性成分有升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷等色原酮类以及多糖、挥发油等，具有解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集等多种功效［2-3］。目前，评价防风药材以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷4种色原酮为主要药效物质和质量控制评价指标［4］。本文以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷4种色原酮为指标，建立了高效液相色谱法测定防风中4种色原酮的方法，为防风药材色原酮的测定提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CEM-MAR S5微波萃取仪（美国CEM公司）；Agilent1100高效液相色谱仪（在线脱气机、四元泵、DAD检测器、手动进样器和Agilent化学工作站）；AUY220电子天平；HH-6数显恒温水浴锅。

1.2 材料

防风采于吉林农业大学药用植物园 （批号：20101012，20101013，20101014），经吉林农业大学杨利民教授鉴定为防风Saposhni kovia divaricata（Turcz.）Schischk.。升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷对照品 （中国药品生物制品检定所，批号分别为：111522，111710，111523，111714）。

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件

DiamonsilC18（4.6mm×20 0mm，5μm）色谱柱，柱温：30℃；波长：254nm；甲醇－水梯度洗脱（甲醇：0～15min，20%～45%；15～25m in，45%～70%），流速：1m L·min－1。

2.2 供试品溶液的制备

防风根经45℃烘干，粉碎过30目筛。精密称取0.5g样品，加入70%乙醇，称定重量，90℃微波提取4min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，定容于25m L容量瓶中，进样前过0.45μm滤膜。

2.3 混合对照品溶液的配制

精密称取经五氧化二磷干燥后的升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷适量，配成浓度为：升麻素苷0.3m g·m L－1、升麻素0.0 4m g·m L－1、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.5m g·mL－1和亥茅酚苷0.02m g·m L－1的混合对照品溶液。分别精密量取0.25，1，2，3，4，5m L，定容于10m L容量瓶中。

2.4 标准曲线的制备

分别吸取上述对照品溶液20μ L，按色谱条件进样，测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标 （Y），进样量为横坐标 （X），绘制标准曲线，计算回归方程。升麻素苷Y＝3.29×103X＋68.77，r＝0.9998，线性范围：0.15～3μ g；升麻素：Y＝2.58×103X＋7.52，r＝0.9997，线性范围：0.0 2～0.4μ g；5-O-甲基维斯阿米醇苷：Y＝2.0 1×103X＋68.75，r＝0.9996，线性范围：0.25～5μ g；亥茅酚苷：Y＝4.13×103X＋5.31，r＝0.9997，线性范围：0.0 1～0.2μ g。混合对照品和供试品的色谱图见图1。

图1 混合对照品和供试品的HPLC图

2.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液20μ L，按上述色谱条件，每隔4h进样1次，共测定7次。计算4种色原酮峰面积。结果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的R S D值分别为1.41%，2.0 9%，2.13%，1.74%，表明24h内4个对照品稳定性良好。

2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液20μ L，按上述色谱条件进行分析，连续5次，计算4种色原酮峰面积积分的RSD值分别为0.91%，1.54%，1.76%，1.95%。

2.7 重复性试验

精密称取防风样品（2010 10 12）5份，按上述操作方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液20μL，按照上述色谱条件测定峰面积，结果4种色原酮峰面积积分的R S D分别为1.74%，2.68%，2.30%，2.16%。

2.8 回收率试验

取已知含量供试品（2010 10 12）5份，各0.5g，经2.2方法制备后分别加入定量升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及亥茅酚苷对照品，按上述色谱条件测定，计算4种色原酮的回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取防风样品3份，按照上述方法进行含量测定，结果见表2。

表1 色原酮加样回收率测定 /%

表2 防风样品中4种色原酮含量测定结果 /%

3 讨论

实验曾采用 《中国药典》2010年版防风药材测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的方法，即甲醇－水（40∶60）作流动相，流速1m L·min－1时，亥茅酚苷出峰时间延后，峰形变宽；实验还考察了甲醇－水 （50∶50）、甲醇－水梯度洗脱 （甲醇：0～30m i n，15%～70%；0～15m i n，20%～45%，15～25m i n，45%～70%等）作为流动相，最后确定甲醇：0～15min，20%～45%，15～25min，45%～70%梯度洗脱作为流动相，4种色原酮峰的对称性好，与其他物质峰达到完全分离，且保留时间适中，故选为本文的色谱条件。在选定的色谱条件下，该方法的重现性、稳定性、精密度、回收率试验均符合要求，因此可作为防风药材4中色原酮含量的测定方法。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：140.

［2］张贵君，李影.我国生药防风近10年的研究概况［J］.时珍国药研究，1997，8（1）：73-75.

［3］薛宝云，李文，李丽，等.防风色原酮甙类成分的药理活性研究［J］.中国中药杂志，2000，25（5）：297-299.

［4］孙晖，曹玲，王喜军.防风药效物质基础季节积累规律的研究［J］.中国中医药科技，20 0 3，10（6）：355-356.

Determination of the Chromones Contents of Saposhnikovia divaricata by HPLC

CHEN Gui-yu1，GUO Hong-li2，XIANG Dong-yu1
（1．Shangdong College of Traditional Chinese medicine，Yantai 264100，China；2.Baishan Institute for Food＆Drug Control，Jilin Provence，Baishan134300，China）

Objective：A HPLC method was established for determination of the chromones contents ofSaposhni-kovia divaricata.Methods：A Diamonsil C18（4.6mm×20 0mm，5μm）was used with gradient elution of methanol and water that methanol increased from20% to45%in 15minute，and then increased from 45% to 70% until 25 minute as mobile phase；the flow rate was1.0m L·min－1at30℃and the detector wave length was254nm.Results：The re-lationships between the concentration and the peak area of 4 chromones were good linear relation.The calibration curve of prim-O-glucosylcimifugin，cimifugin，5-O-methylvisammioside and sec-O-glucosylhamaudol were at the range of 0.15～3μg，0.02～0.4μg，0.25～5μg and 0.01～0.2μg.Conclusion：The method was rapid，sensitive and accu-rate，and could be used for the determination of chromones of S．divaricata．

Saposhnikovia divaricata；Microwave extraction；Chromones

*项东宇，E-mail：chengy1978＠126.com

2011-0 5-30）