正交试验法优选犬问荆山奈素提取中水解条件的研究

2011-09-20刘计权谢树莲尹晓琴苏志兰

山西中医药大学学报 2011年4期

刘计权，谢树莲，尹晓琴，苏志兰

（1.山西中医学院，山西太原 030024； 2.山西大学生命科学学院，山西太原030006）

犬问荆Equisetum palustre Linn为木贼科问荆属药用植物［1］，据文献资料报道，问荆属中药用植物的主要成分为黄酮醇及二氢黄酮醇类，如山奈素、槲皮素、二氢槲皮素等［2］。药理研究显示，该类成分具有抗心肌缺血、降血压、镇静、以及抗肿瘤、抗癌等作用，且可作为清肝明目、镇痛止血药作为戒毒药品［3-4］。犬问荆广泛分布于全国各地，本实验以山奈素为指标，利用正交试验法对犬问荆山奈素提取中的水解条件进行了优选。

1 实验材料

Waters高效液相色谱仪（515泵，2996紫外检测器）。山奈素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110861-200808）；甲醇为色谱纯，水为双蒸水，磷酸为优级纯，其他试剂均为分析纯。犬问荆采自内蒙赤峰，经鉴定为木贼科问荆属药用植物犬问荆Equisetum palustre Linn。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称取犬问荆0.75 g粉末过三号筛，共9份，置于具塞圆底烧瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷后称定重量，用75%乙醇补足减少的重量，摇匀滤过，精密量取续滤液20 mL加浓盐酸进行水解［5］。水解液于水浴中蒸干，残渣加蒸馏水10 mL溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，水浴挥干溶剂，残渣加乙醇溶解并转移至2 mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀作为供试品溶液。

2.2 水解条件的正交设计

根据文献和预实验［6］，选用L9（34）正交表对水解条件进行正交实验，选用加浓盐酸体积、水解温度、水解时间3项作为考察因素，每个因素3个水平，各因素水平见表1。

2.3 山奈素的测定

2.3.1 色谱条件色谱柱：Sinochorm-ODS BP色谱柱（250 nm×4.6 nm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（56∶44）；流速：0.8 mL/min；柱温：室温；检测波长：365 nm。山奈素对照品和犬问荆供试品HPLC色谱图见图1、图2。

表1 山奈素水解条件因素水平表

2.3.2 对照品溶液的制备精密称取山奈素对照品5.7 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液（含山奈素0.114 mg/mL）。

2.3.3 线性关系考察精密吸取上述对照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置 10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；分别吸取10 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以山奈素进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行回归分析，计算得回归方程为Y=4 636.2X－47 562，r=0.999 9。结果表明：山奈素在 0.057 μg～1.140 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 样品含量测定

精密吸取上述供试品溶液10 μL分别注入色谱仪进行测定，带入回归方程计算山奈素的含量。测定结果及结果分析见表2、表3。

从表2可以看出，不同因素水平对结果影响强弱顺序为：A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，D2＞D1＞D3，从而初步认为最佳水解条件为A1B2D2。为进一步明确各因素的水平变化对实验结果是否具有显著影响，利用方差分析作进一步考察。由表3可知，F0.05＜FD＜F0.01，即因素D（加盐酸量）的水平变化对实验结果有显著影响，因素A（水解时间）和因素B（水解温度）的水平变化对实验结果无显著性影响。从节约的角度考虑，最终确定理想的水解条件为A1B1D2，即60℃下，加盐酸2.5 mL，水解30 min。