噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性研究

王庆 徐东芳

（安徽省结核病防治研究所 合肥 230022）

耐多药结核病（MDR－TB）是新世纪结核病控制面临的严峻挑战之一［1]。对于耐多药的治疗需通过药物敏感性实验选择有效的药物，氟喹诺酮类药物包括氧氟沙星（Ofloxacin，OFX）因其良好的抗结核活性，成为目前治疗耐药结核病广泛应用的二线药物之一［2]。但常规耐药性检测方法时间太久，严重滞后临床治疗的需要。因此，快速准确的氧氟沙星耐药性检测技术对临床治疗及控制结核病具有重要的意义。噬菌体生物扩增法（phage amplified biologically assay，PhaB）是一种新型的表型技术，可快速诊断结核病和结核的药物敏感性，一般不超过4d就得知药敏结果，本文应用噬菌体生物扩增法对205株结核分枝杆菌氧氟沙星的耐药性检测，并与常规使用的绝对浓度法药敏结果进行比较，对不一致菌株进行WHO推荐的比例法测定，以评价PhaB检测结果的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 噬菌体及其检测试剂 均为上海市肺科医院结核病重点实验室惠赠，具体见文献［3] 。

1.1.2 药物及其浓度 OFX药粉购自Sigma公司，用0.4%NaOH溶解后，再用无菌蒸馏水配制为1mg／ml，－20℃保存，PhaB法应用时稀释至16μg／ml。

1.1.3.试 菌 株 H37Rv 标 准 菌 株 （ATCC 95054）购自中国疾病预防控制中心结核病防治临床中心国家菌种保藏中心，205株MTB临床分离株均为本实验室库存菌株，全部来自我院确诊的肺结核患者的痰标本培养物，并经常规生化反应鉴定为MTB。检测前，将待检菌株转种至改良罗氏培养基37℃培养2～3周。检测时，刮取菌落少许，磨菌后用液体培养基调整浊度至1个麦氏单位，相当于1mg／ml，1∶500稀释后待检。

1.2 方法

1.2.1 PhaB法 按相关参考文献［4] 的方法进行，但有以下不同。吸取1∶500稀释的待检菌液0.2ml，加入16μg／ml OFX 0.2ml（OFX终浓度为8μg／ml），对照管加0.2ml液体培养基，混匀后置37℃培养72h；各管加0.1ml噬菌体，37℃温育1h；各管再加0.1ml杀毒剂（噬菌体灭活剂），充分混匀，室温作用5min；各管混合物分别加入提前倒入平板的5ml液体培养基和1ml指示细胞混匀，加入5ml溶化的琼脂（日本进口分装），旋转混匀，37℃培养18～24h后观察噬菌斑形成情况。分别计算每个菌株的加药管与对照管的噬菌斑减少百分比。以加药管与对照管的噬菌斑减少百分比≥90%判为敏感，反之为耐药。每次实验均以H37Rv标准株作为对照。

1.2.2 绝对浓度法和比例法测定OFX耐药性按中国防痨协会制定的《结核病诊断细菌学检验规程》［5]配制罗氏OFX药敏培养基进行常规的绝对浓度法和比例法OFX耐药性检测，绝对浓度法药物浓度分别为3、10μg／ml，比例法的药物浓度为2μg／ml，每次实验均以H37Rv标准株作为对照。

2 结果

2.1 检测方法学研究

2.1.1 药物浓度和作用时间选择 采用终浓度为1、4、8、16μg／ml系列梯度稀释的OFX，分别与结核分枝杆菌OFX敏感株和耐药株作用24、48和72h，然后进行噬菌体检测。结果表明在OFX终浓度为8μg／ml时，无论作用24、48和72h，耐药株均出现大量噬菌斑；而敏感株作用24和48h均有噬菌斑，作用72h后无噬菌斑，因此选择OFX终浓度为8μg／ml，药物作用时间为72h。

2.1.2 稳定性试验 采用同样的测定条件，1d内对3株OFX耐药株和3株敏感株检测2次，连续5d，观察测定方法的稳定性。结果表明，每次检测敏感株均判断为敏感，耐药株均判断为耐药。此外，无药对照管的噬菌斑数量基本相似。

2.2 临床菌株的OFX耐药性测定结果 采用PhaB法检测205株结核分枝杆菌临床分离株OFX耐药性，并与常规绝对浓度法药敏结果进行比较，结果见表1。以绝对浓度法药敏结果为判断标准，则PhaB法测定OFX耐药性的敏感性为95.4%（83／87），特异性为 93.2%（110／118），阳性预测值为91.2%（83／91），阴性预测值为96.5%（110／114），准确性为94.1%（193／205）。2种药敏方法比较χ2＝0.75＜χ0.052＝3.84，显示PhaB法与绝对浓度法测定OFX耐药性结果差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 噬菌体法与绝对浓度法测定OFX耐药性结果（株）

2.3 不一致菌株的氧氟沙星比例法测定 12株PhaB法与绝对浓度法测定OFX耐药性结果不一致的菌株，通过比例法耐药性监测，其中4株PhaB法测定为OFX敏感而绝对浓度法测定为耐药的菌株中，有3株（75%）比例法测定为敏感，1株（25%）比例法为耐药，在8株PhaB法测定为OFX耐药而绝对浓度法敏感的菌株中，比例法测定耐药6株（75%）、敏感2株（25%），结果见表2。

表2 噬菌体法与绝对浓度法测定OFX耐药性不一致的菌株比例法结果 株

3 讨论

分枝杆菌噬菌体在1947年首次分离，至今已分离出250余种［6]。近年来，分枝杆菌噬菌体在结核病快速诊断及耐药性测定中的研究报道逐渐增多［7]。该方法的基本原理是分枝杆菌噬菌体能感染活的结核分枝杆菌，如待检菌株为耐药株，则可正常生长，并被噬菌体感染，噬菌体在感染的菌体内得到保护，不会被随后加入的杀毒剂杀死（而敏感株因被药物杀死，噬菌体无法进入菌体内，而被随后加入的杀毒剂杀死）。噬菌体在感染的菌体内大量繁殖，并将菌体裂解，释放出的噬菌体可立即感染随后加入的指示细胞，噬菌体使指示细胞裂解，在培养皿上出现肉眼可见的噬菌斑。因此，只要根据噬菌斑的有无即可判断待检菌株的耐药性。

耐药浓度的界定是要以已建立的标准方法及临床评估方法取得最高一致率的原则而确立的。在本研究中将OFX的耐药临界浓度界定为8μg／ml和作用时间为72h是通过预试验选定的，该耐药临界浓度检测结核分枝杆菌耐药性时与绝对浓度法取得最大一致性。国外关于PhaB法检测氧氟沙星的相关报道较少，国内杨华等［8]对氧氟沙星抗结核分枝杆菌的临床耐药界限的研究建议16μg／ml是较理想的耐药临界浓度，而我们采用了8μg／ml，可能原因是培养基不同，我们采用的是改良的罗氏培养基，而杨华等采用的是7H9液体培养基。本研究中，PhaB法对205株结核分枝杆菌临床分离株进行OFX药敏试验结果显示，以绝对浓度法药敏结果为判断标准，敏感度为 95.4%（83／87），特异度为93.2%（110／118），阳性预测值为91.2% （83／91），阴性 预 测 值.96.5% （110／114），总 符.率 为94.1%（193／205）。与国内黄学锐等［9]的结果相比，较为一致。另外，对噬菌体法与绝对浓度法测定OFX耐药性结果不符的12株菌株，我们采用了WHO／IUATLD全球结核病耐药监测项目推荐的比例法进行耐药性检测，该方法具有较高的稳定性，可重复性高特点。实验结果表明其中的9株噬菌体法检测结果与比例法相符，符合率为75.0%（9／12），12株的噬菌体法与绝对浓度法结果不一致，矛盾出现的可能原因有：一是在结核分枝杆菌复合群的亚培养株中耐药株占的比例增高或者代谢活性的改变，对药物己不敏感，造成假阳性；二是绝对浓度法可能因方法上的缺陷如菌量接种误差导致测定结果不准，也可能是这两种方法判定标准的不同导致的差异，标准的不同对结果影响很大，可能会得到相反的结论。且绝对浓度法目前虽然是我国推荐的常规药敏方法，但OFX作为二线药物，药敏测定的浓度至今尚无参考依据，使罗氏药敏测定OFX耐药性存在不足，也会导致测定结果不准确。

综上所述，噬菌体生物扩增法测定OFX耐药性确有较高的敏感性和特异性，不需要特殊仪器设备、经济安全等特点，有可能成为耐药结核病的实验室快速诊断方法之一。但我们在检测过程中体会到应注意以下几点：（1）每次实验必须设全各种对照，如阴性对照、阳性对照和杀毒剂对照等以保证检测结果的可靠性；（2）加入杀毒剂后一定要彻底摇匀，以杀死全部未进入菌体里的噬菌体；（3）浇注平板时琼脂的温度为55℃，不宜过高，以免灭活噬菌体；（4）避免操作污染，以防影响结果观察。

［1] Smith KC，Armitige L，Wanger A.A review of tuberculosis：reflections on the past，present and future of a global epidemic disease［J] .Expert Rev Anti Infect Ther，2003，1（3）：483－491.

［2] 何国钧，肖和平.抗结核药物的研究进展［J] .中华结核和呼吸杂志，2000，23（10）：621－625.

［3] 胡忠义，倪莲娣，靳安佳，董惠贤，钟敏，李建农，翁心华.噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌方法学研究［J] .中华结核和呼吸杂志，2004，27：801－805.

［4] 王洁，崔振玲，胡忠义，张滢蓉，乐军，张文宏，翁心华.噬菌体法同时检测四种一线抗结核药物耐药性［J] .中华传染病杂志，2006，24（2）：102－105.

［5] 中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断细菌学检验规程［M] .北京：中国教育文化出版社，2006：34.

［6] McNerney R.TB：The return of the phage.A review of fifty years of mycobacterio phage research［J] .Int J Tuberc Lung Dis，1999，3：179－184.

［7] 王庆，金玉莲，李建农，柴华，孙道霞，包训迪.四种方法检测结核分枝杆菌耐药性结果的比较及方法评价［J] .中华传染病杂志，2007，25：690－694.

［8] 杨华，王洁，周新刚，崔振玲，陆俊梅，胡忠义.噬菌体生物扩增法和最低抑菌浓度法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性［J] .中华临床医师杂志，2007，4：21－24.

［9] 黄学锐，高微微，张旭霞，王甦民，潘毓萱，马玙.氧氟沙星和左氧氟沙星抗结核分枝杆菌临床耐药界限的研究［J] .中华结核和呼吸杂志，2004，27（2）：84－88.