益气养阴活血方对病毒性扩张型心肌病小鼠TNF－αmRNA表达的影响1）

安 静，陈会君

本研究根据慢性心肌炎及早期扩张型心肌病（DCM）患者之气阴两虚、瘀血阻滞、热毒残留的症候特点。观察益气养阴活血方对小鼠心肌组织病理形态学变化及心肌组织肿瘤坏死因子－α（TNF－α）的影响，初步揭示作用机制，为中医药早期治疗DCM提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 210只雄性Balb／c小鼠，体重10g，3周～4周龄，由北京军事医学科学院实验动物中心提供。分笼饲养，每笼10只室温（26±3）℃，均食用普通饲料。

1.2 病毒 柯萨奇B3m（CVB3m）病毒（Nancy株，购自哈尔滨医科大学克山病研究所），在Hela细胞中传代，冻融3次，离心（2 000r／min，10min），上清液分装，在 Hela细胞中测50%组织感染率（TCID50）为10－7，－70℃保存备用。

1.3 实验用药 益气养阴活血组方：黄芪、红参、生地、麦冬、五味子、川芎、丹参、兰根、大青叶、桔梗、升麻、远志、柏子仁、合欢皮。中药经水提取，制成浸膏，含水量为21%。用蒸馏水稀释，调整浓度为82%，即相当于每毫升悬液中含生药4.3g备用。黑龙江中医药大学制剂室提供。生产日期：20051108。

1.4 主要试剂 试剂盒TrizolRNAIsolation、反转录试剂盒由美国Invitrogen公司提供、TaqDNA聚合酶由大连宝生物有限公司提供。PCR Marker试剂盒由美国Promega公司提供。PCR引物，应用引物设计软件Primer5.0设计引物，上海捷倍思基因有限公司合成。详见表1。

表1 PCR引物序列

1.5 模型制备及分组 3周～4周龄雄性Balb／c小鼠共210只，自然光线，自由饮水，自由摄食条件下适应性喂养1周。1周后，其中180只Balb／c小鼠随机分为4组：正常对照组、模型组，中药高、低剂量组。正常对照组30只，模型组，中药高、低剂量组各60只。中药高剂量组、中药低剂量组、模型对照组均于实验的1d、8d、15d、22d、36d、50d分别予腹腔注射 RM1640液稀释的0.1mL10－4TCID50CVB3m、0.1mL 10－3TCID50CVB3m、0.2 mL10－3TCID50CVB3m、0.1mL10－3TCID50CVB3m、0.1 mL10－4TCID50CVB3m、0.1mL10－4TCID50CVB3m。正常对照组分别于实验同期注射同体积的RM1640液。

1.6 给药方法 各组均于末次病毒注射后10d，即实验的第60天开始灌胃。中药低、高剂量组均给予益气养阴活血方混悬液灌胃，剂量分别为10.35g／（kg·d）及20.7g／（kg·d），以上给药剂量均为生药量。模型对照组和正常对照组灌以同体积蒸馏水。每日1次灌胃，连续4周。

1.7 取材 称重后将小鼠用颈椎脱臼的方式处死，置入盛70%乙醇的烧杯中，使其体毛完全润湿。小鼠置于70%乙醇润湿纸巾，剪开将腹部皮肤，无菌取出心脏，将血液拭干，称重后取1／2投入液氮罐中，－70℃低温冰箱保存，备反转录－聚合酶链反应RT－PCR）mRNA检测。

1.8 检测指标及方法 RT－PCR法检测心肌组织肿瘤坏死因子mRNA表达。

1.9 统计学处理 应用SPSS11.0软件分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组均数间比较用方差分析，两两比较用q检验。等级资料组间比较应用秩和检验。样本率比较用χ2检验。

2 结 果

2.1 小鼠心肌组织TNF－αmRNA电泳条带比较 TNF－α mRNA在琼脂糖电泳凝胶上紫外灯下观察均可见653bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异。各组β－actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为432bp。

2.2 小鼠心肌组织TNF－αmRNA电泳产物灰度扫描值变化（见表2） 与正常组相比，模型组、中药组小鼠TNF－αmRNA表达明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，中药高、低剂量组TNF－αmRNA表达明显降低（P＜0.01）；中药高剂量组与中药低剂量组相比，心肌组织TNF－αmRNA表达降低的更明显（P＜0.01）。

表2 TNF－αmRNA电泳产物灰度值变化比较（±s）

表2 TNF－αmRNA电泳产物灰度值变化比较（±s）

组别 n TNF－α／β－actin正常对照组 28 0.003 0±0.000 8模型组 33 0.385 7±0.092 21）中药低剂量组 39 0.216 6±0.034 31）2）中药高剂量组 29 0.186 3±0.019 11）2）3）与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与低剂量比较，3）P＜0.01

3 讨 论

在病毒性心肌炎发病及其向扩张型心肌病演变的过程中，心肌细胞及浸润心肌的巨噬细胞和T淋巴细胞，以及心肌组织中的成纤维细胞和内皮细胞等均可合成并释放肿瘤坏死因子[1，2]。生理情况下，TNF－α具有调节免疫应答、促进细胞生长分化、参与机体免疫应激反应及抗病毒等多种生物活性，但当它们过度产生或长期存在于心肌组织中时，也会对心脏结构和功能造成不利影响。注射外源性重组人TNF－α会使心肌细胞病毒含量增高，心肌坏死及细胞浸润更严重，心肌炎加重。而抗TNF－α抗体能改善其心肌损害，延长存活时间[3]。TNF是病毒性心肌炎发病机制中致心肌损伤的重要因素之一。在非应激状态下时，正常的心肌组织是不合成及释放TNF－α，与本实验中正常对照组小鼠心肌组织中TNF－αmRNA的情况一致。而和正常组小鼠比较，其余各组小鼠心肌组织TNF－αmRNA表达均明显升高（P＜0.01）。益气养阴活血方能明显抑制小鼠心肌组织TNF－αmRNA的表达，减轻由TNF－α所引发的一系列免疫反应，减轻心肌病理形态及超微结构的改变，且以中药高剂量组的作用最为明显。益气养阴活血方的作用机制可能是：早期通过降低心肌TNF－α含量，以减缓炎症细胞的聚集，活化和炎症介质的释放、减轻心肌组织的炎性病变。后期抑制心肌成纤维细胞和间质细胞增生，减缓心肌胶原酶、蛋白酶的合成，防止心肌组织异常增生、肥大及纤维化，减轻DCM的病理损伤[4，5]。通过抑制TNF－α对心肌细胞主要MHC－Ⅱ类抗原异常表达的诱导功能，从而阻断T细胞介导的一系列自身免疫反应。减轻了对心肌细胞的损害，改善了心肌组织的功能，延缓了慢性心肌炎向DCM发展的进程，对早期扩张型心肌病起到了较好的治疗作用。

[1]王哲，杨继红，张腊蒲.参麦注射液合用1，6二磷酸果糖治疗小儿病毒性心肌炎疗效观察[J].中西医结合心脑血管病杂志，2007，5（5）：440－441.

[2]程志清，张娟，刘宏飞.清心Ⅱ号对病毒性心肌炎急性期小鼠Th细胞分化与凋亡干预作用的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（1）：44－46.

[3]王再谟，傅荣周，唐章全.现代中药临床应用[M].北京：人民卫生出版社，2005：259.

[4]程志清，张娟，刘宏飞.清心Ⅱ号对病毒性心肌炎急性期小鼠Th细胞分化与凋亡干预作用的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（1）：44－46.

[5]程志清，张娟，刘宏飞.清心Ⅱ号对病毒性心肌炎急性期小鼠Th细胞分化与凋亡干预作用的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（1）：44－46.