心脉隆注射液HPLC指纹图谱建立方法的研究

焦春香， 张成桂， 刘光明， 李树楠

(大理学院药学院，云南大理671000)

心脉隆注射液是一种从美洲大蠊Periplanta americana linneus提取物中精制而成的中药静脉注射制剂，对充血性心力衰竭、肺心病、右心衰临床疗效良好，有着起效快、疗效确切、安全可靠等优点。心脉隆注射液中含有复合核苷类和结合氨基酸等多种化合物，其中复合核苷类是主要有效成分，结合氨基酸可使复合核苷类的药效作用增强［1-2］。本实验采用离子色谱去除结合氨基酸部分及其他杂质，尽量纯化复合核苷类，再通过RP-HPLC建立心脉隆注射液指纹图谱。

1 仪器与试药

中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004，国家药典委员会);Agilent 1100液相色谱仪，DVD-二极管阵列检测器，Agilent LC色谱工作站;甲醇(色谱纯)，重蒸水(实验室自制)，冰乙酸、乙酸钠均为分析纯，强碱性阴离子交换树脂717(粒度0．3-1．2 mm)购自安徽三星树脂科技有限公司。

美洲大蠊药材5批(1昆明养殖场，2008;2昆明养殖场，2008;3宾川养殖场，2007;4弥渡养殖场，2007;5弥渡养殖场2006)购于各养殖基地。心脉隆注射剂10批(李树楠教授提供，批号20050412、20050610、 20050401、 20050405、 20050404、20050607、200703、200606、20050603、20060604。依次编号为1～10。);尿嘧啶对照品购自sigma公司(货号U0750，纯度大于99%)。

2 试验方法与系统适应性

2．1 供试品制备 注射液供试品的制备:强碱性阴离子交换树脂717经过处理，以其水悬液装柱，层析柱内径1．5 cm，树脂床高2．0 cm，表面覆盖一滤纸圆片［3］。用蒸馏水洗脱后，再加 0．5 mol/L NaOH溶液约5 mL，待流出后用蒸馏水10 mL洗脱，备用。精密量取供试样品1．0 mL，加0．5 mol/L NaOH 溶液0．25 mL，调节pH至9加于柱上，待流出后用蒸馏水10 mL洗脱。加0．2 mol/L乙酸溶液;待浅色洗脱前缘向下移动到树脂柱下端约0．4 cm处时开始收集洗脱液，至其体积为22 mL时停止，加入1 mol/L NaOH溶液，定容至25 mL，混匀，即为供试品检测液。用0．45μm的微孔滤膜滤过。

美洲大蠊药材供试品溶液的制备:称取25 g美洲大蠊干粉，200mL 95%乙醇80℃回流1 h，过滤;取滤液100 mL，60℃减压浓缩至干，所得浸膏加50 mL蒸馏水温溶，过滤。滤液应澄明清亮。精密量取5．0 mL过滤液经强碱性阴离子交换树脂717处理，方法同上。

对照品溶液的制备:精密称取预置于干燥器中的标准品适量，用50%甲醇水溶液配成0．25 mg/mL溶液，使用时将其用水准确稀释为0．05 mg/mL溶液。

2．2 色谱条件 流动相A:0．02% 乙酸缓冲溶液(pH=5．0)，流动相 B:100%甲醇;Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4．6 mm ×150 mm，5 μm);检测波长254 nm;柱温30℃;体积流量0．8 mL/min;运行时间15 min;进样量10μL。梯度程序:0 min，95%A+5%B;3 min，90%A+10%B;6 min，85%A+15%B;9 min，80%A+20%B;14 min，85%A+15%B;15 min，95%A+5%B。在上述色谱条件下，理论板数不低于10 000。

2．3 精密度试验 取供试品溶液(批号20050412)，在所建立的测定条件下，连续进样5次采用夹角余弦法对全图谱进行计算，5次进样的色谱图其相似度均为0．99以上，同时以尿嘧啶色谱峰保留时间及峰面积为参照，5次共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，相对保留时间 RSD低于1%;峰面积占总峰面积1%以上的各共有峰相对峰面积RSD低于3%，显示进样的精密度良好。符合指纹图谱研究技术的要求［4-5］。

2．4 稳定性试验 取供试品溶液(批号20050412)，分别在48 h内不同时间段进样9次，按所建立的测定条件进行检测，采用上述方法对所得结果进行计算，其相似度均为0．95以上，同时以尿嘧啶色谱峰保留时间及峰面积为参照，共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致。结果表明在48 h内，心脉隆注射液的色谱指纹图谱基本稳定，其RSD均低于3%，符合指纹图谱研究技术的要求［4-5］。

2．5 重现性试验［6］取 同 一 批 注 射 液 (批 号20050412)10份，精密量取，按2．1项下制备，按2．2项下条件检测，记录5份样品色谱峰的保留时间及峰面积值。采用夹角余弦法对10次测定结果的全图谱进行相似度计算，其相似度均为0．94以上，同时以尿嘧啶色谱峰保留时间及峰面积为参照，共有峰的相对保留时间的RSD低于1．8%;相对峰面积的RSD值为4．3%，结果表明方法重现性良好。

3 结果与分析［5，7］

3．1 共有峰确定 测定10批心脉隆注射液，指纹图谱见图1。比较其色谱图，确定共有峰为12个，峰面积占总峰面积0．5%以上的共有峰有8个。以尿嘧啶为参照物，尿嘧啶色谱峰(S峰)的保留时间和峰面积为1，分别计算其余共有峰的相对保留时间和峰面积积分值比值(见表1、2)。测定各峰相对保留时间RSD ＜3．0%，共有指纹峰的峰面积之和占总峰面积的比值大于95%。

表1 心脉隆注射液共有指纹峰相对保留时间(n=10)Tab．1 Reletive tR of common fingerprint peaks of Xinmailong Injection(n=10)

表2 心脉隆注射液的指纹图谱共有峰相对峰面积(n=10)Tab．2 Reletive of copossessing fingerprint peak area of Xinmailong Injection(n=10)

图1 10批心脉隆注射液的指纹图谱和共有模式(R)Fig．1 Themathed chromatogram and fingerprint common pattern(R)of 10 batches of Xinmaitong Injection

根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》［4］中要求，单峰面积占总峰面积大于或等于20%的共有峰峰3(S峰)，相对峰面积RSD小于±20%;单峰面积占总峰面积大于或等于10%，而小于20%的共有峰峰4、峰6，RSD分别为14%，12%，均小于±25%;单峰面积占总峰面积小于10%，而大于等于5%的共有峰峰5、峰7，RSD分别为15%，22%，均小于±30%;峰面积比值小于5%的共有峰不作要求。

3．2 指纹图谱相似度分析 指纹图谱相似度测试的方法有很多，这里选用了相关系数法和夹角余弦法对色谱峰峰高、峰面积和全图谱的相似度进行了评价［7］，以1号注射液样品指纹图谱为参照，结果见表3。无论是峰面积、峰高、全图谱相似度都达到0．98以上，说明不同批次心脉隆注射液的色谱图相关性良好。

3．3 药材与注射液的相关性 分别取美洲大蠊药材、心脉隆注射液各5批，按上法操作后进样测定。以1批药材指纹图谱为参照，结果见表4。不同养殖场的美洲大蠊药材不是很稳定，与注射剂的相关性不是很好。如表4相似度分析，虽然峰面积和峰高相似达到0．90以上，但是夹角余弦法分析全图谱的相似度不是很高，一方面是不同批次的美洲大蠊药材之间相似度低于0．90，另一方面药材与注射剂之间相似度也低于0．90。

表3 10批心脉隆注射液相似度分析Tab．3 The correalation of 10 batches of Xinmaitong Injection

表4 5批药材与5批注射剂相似度分析Tab．4 The correalation of 5 batches of between Xinmailong Injection and medicinalmaterials

4 讨论

心脉隆注射液成分复杂，从药材和制剂制备供试品液，应尽可能保留核苷类成分，去除制剂的添加成分和污染反相色谱柱的部分。根据核苷碱基的性质，拟采用离子交换色谱法制备供试品溶液。王利春等采用阳离子交换树脂纯化美洲大蠊药材中核苷类物质［8］。因核苷碱基具有离解基团如NH-CO或咪唑基中的-NH-，具有弱碱性;在pH值约9．0时，核苷碱基可交换吸附在强碱性阴离子交换柱上，用乙酸洗脱核苷碱基，从而达到纯化目的。故本实验选用强碱性阴离子交换树脂。该样品纯化方法可靠，连续10次纯化的样品图谱相似度可达到0．94以上，共有峰的相对保留时间的RSD低于1．8;相对峰面积的RSD值为4．3%。色谱条件采用甲醇-磷酸盐溶液为流动相，分离效果较好、各峰分离度较大、基线平稳、保留时间适中。

参照物首选有标准品提供的君药中主要有效成分，其次是其它有效成分，再次是大量存在的指标成分，最后才选一定的内标作为参照物。选择有效成分的优点是可以方便地通过峰值比，控制相对的量比，为以后成分和药效相关性提供一定依据［5］。故本实验选取了心脉隆注射液中含有量比较高的尿嘧啶为参照物。

中药现代化要求中药注射剂都必须有指纹图谱作为质量标准。心脉隆注射液于2006年取得新药证书，必须建立指纹图谱。根据其有效成分，本实验做了一定的探索，初步建立的指纹图谱符合《中药注射剂指纹图谱的技术要求(暂行)》，但也发现美洲大蠊药材的质量存在一定问题。

［1］李树楠，胡 忠．治疗心血管疾病的药用制剂:中国，94118839．6［P］．1996-06-12．

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［4］国家药品监督管理局．国药管注［2000］348号:关于印发《中药注射剂指纹图谱的技术要求(暂行)》的通知［S］．2000．

［5］曹 进，饶 毅，沈 群，等．中药注射剂指纹图谱分析［J］．世界科学技术—中药现代化，2001，3(4):20-25．

［6］屠鹏飞．高效液相色谱法制定中药材和中药注射剂特征指纹图谱的探讨［J］．中成药，2000，22(7):516．

［7］程翼宇，陈闽军，吴永江．化学指纹图谱的相似性测度及其评价方法［J］．化学学报，2002，60(11):2017-2021．

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