高脂饮食+STZ诱导的2型糖尿病模型大鼠表征及其证候动态演变研究*

吴 晏，韩 静，黄黎明，郭淑贞，王 伟

（北京中医药大学，北京 100029）

高脂喂养合并腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）是目前应用较多的2型糖尿病大鼠模型的制备方法。采取2次注射 STZ法，成模率高，死亡率低，且成模稳定［1、2］。本研究复制此种动物模型设计观察量表，连续12周全面、动态观察动物的表征变化并判定其证候属性，以判断此种动物疾病模型在不同病变阶段是否存在不同的表征和证候特点。

1 材料

1.1 动物

健康雄性5周龄 SD大鼠40只，体质量120g±10g，由北京维通利华实验动物中心提供（许可证号为SCXK（京）2006-0001），饲养于北京中医药大学清洁级实验动物中心，室温18℃ ～25℃，相对湿度50％ ～60％，大鼠适应性饲养1周。

1.2 饲料

普通饲料和高脂饲料均由中国医学科学院实验动物研究所加工提供。高脂饲料配方：猪油12％，蛋黄粉10％，蔗糖10％，维持饲料68％。

1.3 试剂

柠檬酸（批号 0602102），柠檬酸钠（批号20070403），购自北京化学试剂公司；STZ，Sigma公司。

2 方法

2.1 STZ 配制

配制0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调节pH为4.4；配制 1％STZ溶液，溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，在冰浴中操作。

2.2 分组

按体质量将40只大鼠随机分为正常组和模型组2组，每组20只。

2.3 造模方法

正常组给予普通饲料，模型组适应性饲养1周后，给予高脂饲料喂养。4周后，模型组第1次腹腔注射 STZ溶液35mg/kg，正常组腹腔注射同等剂量0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。第 1次注射STZ后2周，模型组大鼠再次腹腔注射 STZ溶液35mg/kg；正常组腹腔注射同等剂量 0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。尾静脉采血测定空腹血糖（FBG），并进行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）［3］，凡空腹血糖值≥7.8mmol/L者纳入实验［2］。空腹血糖值 ＜7.8mmol/L者按照原剂量再腹腔注射1次STZ。

2.4 指标检测

2.4.1 表征采集 表1显示，课题组根据大鼠表征采集表对2组大鼠逐一观察并判断，从STZ注射前1周开始每周观察1次。如遇分歧采用其中2人的相同观点。

2.4.2 观察指标 各组每2周测量1次体质量、24h饮食量、饮水量；注射 STZ前1d各组经尾静脉采血测定空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FIN）、总胆固醇（TG）、甘油三酯水平（TC），并测定 OGTT。2次STZ注射后第2、6周，各组大鼠尾静脉采血测定FBG并测定 OGTT。2次STZ注射后第10周测定各组动物的 OGTT，然后经腹主动脉取血检测 FBG、FIN、TG、TC水平，并处死所有动物。血糖采用美国强生公司的onetouch随手测血糖仪及血糖试纸测定。血清胰岛素采用中国原子能科学研究院I1252胰岛素放射免疫分析药盒测定，用大鼠标准品绘制标准曲线。血清 TC、TG由全自动生化分析仪完成测定。

2.4.3 OGTT 大鼠禁食 15h后，灌胃给予20％的葡萄糖溶液2g/kg。检测0min及葡萄糖灌胃后30、60、120min的血糖，计算葡萄糖曲线下面积（AUC）=（血糖值0min+血糖值 30min）×0.5/2+（血糖值30min+血糖值 60min）×0.5/2+（血糖值60min+血糖值120min）×1/2。

2.5 统计学方法

采用 SPSS13.0统计软件处理，数据用 珋x±s表示，组间比较用 One Way Anova方差分析。

2.6 判断标准

大鼠表征属性判断标准参照《中医诊断学》［4］。

3 结果

3.1 糖尿病大鼠的一般特征

表1 大鼠表征观察量表

表2、3显示，注射 STZ之前，模型组大鼠 FIN、TG水平明显高于正常组大鼠水平（P＜0.05）；同正常对照组相比，模型组大鼠 FBG、空腹血清 TC水平无明显差异（P ＞0.05）。

2次STZ注射后第2、6周，模型组大鼠FBG值均显著高于正常组大鼠水平（P＜0.01）。2次 STZ注射后第10周，模型组大鼠 FBG、空腹血清 TG、TC值均明显高于正常组水平（P＜0.05，P＜0.01），模型组大鼠FIN值与正常组相比无明显差异（P＞0.05）。

3.2 大鼠葡萄糖耐量结果的比较

表4显示，注射STZ之前，模型组大鼠与正常组大鼠的AUG水平无明显差异（P＞0.05）；2次 STZ注射后第2周直至第10周，模型组大鼠的 AUG水平均显著高于正常组大鼠（P＜0.01）。

表2 大鼠 FIN、TG和 TC水平的比较

表3 大鼠FBG水平的比较

表4 大鼠葡萄糖耐量结果的比较

3.3 大鼠的体质量变化

表5显示，注射STZ之前，模型组大鼠与正常组大鼠的体质量水平无明显差异（P＞0.05）；第1次 STZ注射后7d直至2次 STZ注射后第10周，模型组大鼠的体质量水平均显著低于正常组大鼠（P＜0.01）。

表5 不同时间2组大鼠体质量、24h进食量、24h饮水量的比较

3.4 大鼠24h进食量和饮水量的变化

表5显示，注射STZ之前，模型组大鼠与正常组大鼠24h进食量和饮水量无明显差异（P＞0.05）；第1次STZ注射后7d直至2次STZ注射后第10周，模型组大鼠的24h进食量和饮水量均明显高于正常组大鼠（P ＜0.05，P ＜0.01）。

3.5 2组大鼠表征变化的比较

模型组大鼠在2次 STZ注射后第1～4周出现活动次数增加比率、背温升高比率、各自爬卧比率、舌色鲜红比率、舌干少津比率、爪干燥或脱屑比率升高，并与正常组有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。

模型组大鼠在2次注射STZ后6～10周出现活动次数减少比率、毛潮湿比率、舌色鲜红比率、舌干少津比率升高，并与正常组有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。

表6显示，在第 1次注射 STZ后7d直至2次STZ注射后10周，模型组大鼠的尿量增加比率始终显著高于正常组（P＜0.01）。

表6 2组大鼠表征比率的比较

4 讨论

动物模型是中医药基础研究的桥梁和重要载体，在中医理论研究以及中药新药研究中，迫切需要能够达到现代医学疾病诊断标准的同时又能充分体现中医辨证论治理论特点的新型动物模型，目前此项研究工作尚处于起步阶段。以往的研究报道中，关于动物表征采集方面的内容报道较少，尤其是连续、全面地对不同疾病阶段动物的表征进行采集的研究更为鲜见。本课题组拓展实验动物表征观察项目并进一步完善观察方法，制订出一套较为系统和全面的观察量表。依据临床病证结合条件下的证候诊断标准，按照相同或相似病理生理意义的原则，在动物模型将表征进行等效病理生理意义的转化，以动物表征作为部分临床四诊信息的替代，然后根据中医临床证候诊断标准对模型动物的证型进行初步判定。

本研究结果提示，模型动物从2次 STZ注射2周后至 2次 STZ注射后 10周观察结束，FBG、TG、TC、AUG值均明显高于正常组水平；FIN值先升高后与正常组水平相似，同时出现模型动物体质量降低、尿量增加、24h进食量和饮水量增加。由此认为，本研究中2型糖尿病大鼠模型复制成功。在2次STZ注射后1～4周，与正常组相比，活动次数增加，背温升高，各自爬卧，舌色鲜红、舌干少津、爪干燥或脱屑比率均明显升高，且多饮、多食、多尿、体质量降低。根据《中医诊断学》中对于消渴阴虚内热证咽干口燥、心烦畏热、渴喜冷饮、多食易饥、溲赤便秘、舌红苔黄的描述，认为在2次 STZ注射后1～4周，模型大鼠与阴虚内热证的表现基本相符，故判定为阴虚内热证型。在2次注射 STZ后6～10周，与正常组相比，模型大鼠的活动次数减少、毛潮湿、舌色鲜红、舌干少津比率均明显升高，且多饮、多食、多尿、体质量降低。根据《中医诊断学》中对于消渴气阴两虚证咽干口燥、倦怠乏力、气短懒言、多食易饥、口渴喜饮、溲赤便秘、舌红少津的描述，认为在2次注射STZ后6～10周，模型大鼠与气阴两虚证的表现基本相符，故判定为气阴两虚证型。

由本研究结果可见，模型动物在同一疾病的不同阶段其表征特点确有变化，并出现了统计学意义。由此，对同一时间点出现的多个表征进行汇总分析，将使对疾病模型动物进行中医证型的判定成为可能。由本研究结果可见，在动物疾病模型中同样存在着证型的阶段性，即每种证型都具有一定的持续时间（时间窗），如阴虚内热证在2次 STZ注射后1～4周出现，而气阴两虚证在2次STZ注射后6～10周出现。

病证结合动物模型的创建是中药新药对证治疗评价的关键和基础。建立病证结合动物模型日益受到关注并逐渐成为中医实验动物模型发展的新方向［5］。在疾病模型基础上，动态观察模型动物的宏观表征和微观指标，综合结果进行证候判定，在此思路上构建的病证结合动物模型，具有客观性强、可信度高以及更贴近临床等特点，是证候动物模型发展的必然趋势［6］。本课题组在高脂饲料合并注射 STZ所致的2型糖尿病大鼠模型中观察到不同疾病阶段的表征变化特点，用中医诊断学的方法分别判定为阴虚内热证和气阴两虚证，并初步确定了2种证型的时间窗。在下一步的研究中，本课题组将采用糖尿病阴虚内热证和气阴两虚证的代表性方剂对模型动物进行方剂反证，以进一步验证本研究所判定的动物证型的准确性，旨在探讨并创建2型糖尿病病证结合动物模型研究的规律和方法。

［1］郭学军，邹移海，吴 凌，等.链脲佐菌素诱导 SD和 Wistar大鼠糖尿病模型的影响因素［J］.中国实验动物学报，2008，16（4）：4-7.

［2］Ming Zhang，Xiao-Yan Lv，Jing Li，et al. The Characterization of High-Fat Diet and Multiple Low-Dose Streptozocin Induced Type 2 Diabetes Rat Model［J］. Experimental Diabetes Research，2008，704045：1-9.

［3］周迎生，高 妍，李 斌，等.高脂喂养联合链脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征［J］.中国实验动物学报，2005，13（3）：154-158.

［4］朱文锋.中医诊断学［M］.上海：上海科学技术出版社，1995：149-153.

［5］许颖智，张军平.病证结合在中医辨证论治中的地位［J］.中华中医药学刊，2008，26（11）：2362.

［6］刘 涛，王 伟.证候动物模型研究的思索［J］.中华中医药杂志，2006，21（9）：550-551.