贝甲抗癌汤含药血清对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

李 娜，张雯雯

(1山东大学附属省立医院，济南 250021;2山东大学医学院)

贝甲抗癌汤为中药复方汤剂，临床已应用多年，证实其对肝癌有一定的治疗效果。2009年11月～2010年10月，我们观察了中药贝甲抗癌汤含药血清(以下简称含药血清)对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肿瘤细胞株:人肝癌细胞株HepG2(山东大学细胞生物研究所)。昆明小鼠60只，雌雄各半，体质量32～38 g(山东大学实验动物中心)。含药血清:根据参考文献［1］制备。主要试剂:DMEM培养基、胎牛血清(FBS，Gibco公司)，0.25%胰酶、吖啶橙(AO)、MTT(Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，Hepes公司);主要仪器:超净工作台(DL-CJ-2ND，北京东联哈尔仪器制造有限公司)，二氧化碳培养箱(Thermo公司)，倒置显微镜(Nikon公司)，酶联免疫检测仪(Thermo公司)，荧光显微镜(Olimpus公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 HepG2细胞以适量浓度接种于10 cm培养皿中，加入含10%FBS、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中，置于37℃恒温、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁生长2～3 d于倒置相差显微镜下观察细胞铺满约80%传代。传代时吸出培养液，PBS洗1次，胰酶消化，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养皿中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞干预及增殖抑制率测定 根据参考文献［2］制取低浓度、高浓度含药血清。取对数生长期细胞台盼蓝染色。用含10%FBS的DMEM培养液调整细胞浓度至104/ml接种至96孔细胞培养板，100 μl/孔(空白孔只加入细胞培养液 100 μl/孔)，每组设6个平行孔。放入37℃恒温、5%CO2、饱和湿度培养箱培养24 h使细胞贴壁，吸出培养液后分为三组，实验1组、实验2组分别加入低浓度、高浓度含药血清配置的 DMEM培养液100 μl/孔，对照组加入普通DMEM培养液100 μl/孔，空白孔加入普通 DMEM培养液100 μl/孔。培养箱避光培养24、48、72 h 后吸出培养液，加入 1 mg/ml MTT 100 μl/孔，继续培养4 h。4 h后吸出MTT，加入DMSO 150 μl/孔，微量震荡器震荡5 min，使其中的蓝色颗粒充分溶解。将培养板放入酶标仪，测定570 nm处吸光度值(OD值)。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 细胞干预及凋亡率测定 以5×104/ml的浓度接种对数生长期细胞于放置盖玻片的6孔培养板中，每孔2 ml。24 h后吸弃培养液细胞分为三组。实验1组、实验2组分别加入低浓度、高浓度含药血清配置的DMEM培养液2 ml/孔，对照组加入普通DMEM培养液2 ml/孔。继续培养48 h和72 h，细胞飞片TBS洗5 min，95%乙醇固定5 min。0.01%AO避光染色5 min。荧光显微镜下观察10个随机视野，计数凋亡细胞。细胞凋亡率=(凋亡细胞/总细胞数)×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.0软件，应用 t检验，计量数据以表示。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制率 见表1。由表1可见，实验1组、实验2组随作用时间延长，其增殖抑制率逐渐增加，P均＜0.01;实验1组、实验2组间各时点增殖抑制率比较无统计学差异。

表1 各组不同时点细胞增殖抑制率比较(%，)

表1 各组不同时点细胞增殖抑制率比较(%，)

组别24 h 48 h 72 h实验1组13.30 ±1.20 38.61 ±1.43 44.98 ±3.16实验2 组 19.48 ±2.31 36.44 ±1.89 49.00 ±2.32对照组---

2.2 细胞凋亡率 见表2。

表2 各组不同时点细胞凋亡率比较(%，)

表2 各组不同时点细胞凋亡率比较(%，)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别24 h 48 h 72 h实验1 组 7.40 ±1.28* 17.62 ±2.51* 30.74 ±1.32*实验2 组 5.25 ±0.49* 14.00 ±1.21* 28.57 ±2.44*对照组1.52 ±0.83 1.34 ±0.11 2.94 ±0.47

3 讨论

细胞凋亡亦称程序性细胞死亡，不仅对胚胎发生、个体发育和保持机体稳定等生物学功能至关重要，而且在调控细胞增殖、肿瘤形成和发展中起关键作用。凋亡过程的紊乱可促进肿瘤的发生与恶化。研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡是众多肿瘤治疗方法(如放疗、化疗、生物治疗等)的重要药理学机制和生物学效应之一［2］。

中医中药治疗肿瘤具有独特的优势。复方中药成分多样，通过多靶点综合作用以达到抗癌效应，且对正常组织伤害小。研究发现，部分传统中草药有确凿的抗肿瘤作用［3］:蟾酥提取物通过下调凋亡相关基因c-myc等表达而诱导HL-60、ML-1细胞凋亡［4］;柑橘素通过下调Akt和Caspase-3的活性诱导人白血病THP-1细胞凋亡［5］;三七总皂甙在防治结直肠癌中有确切疗效［6］。但绝大多数复方中药(如本方)成分复杂，用药周期较长，确切的抗癌机制尚不完全明确。对中药有效成分和其作用机理的研究是今后工作的重点。贝甲抗癌汤由柴胡、土茯苓、浙贝、炒白术、莪术、薏米、炮山甲、甘草等组成，经水泡煮沸、去药渣，最终生药浓度0.25 g/ml。本研究结果显示，实验1组、实验2组随作用时间延长，增殖抑制率逐渐增加;但两组各时点增殖抑制率无统计学差异;实验1组、实验2组各时点凋亡率均明显高于对照组，但两组间比较无统计学差异。提示含药血清可诱导HepG2细胞凋亡，且药物的时间—效应关系较明确，即随着含药血清作用时间的延长(24～72 h)细胞凋亡明显增加;而剂量—效应关系不明显，可能与药物体内代谢造成有效代谢产物在血清中含量变化(即含药血清浓度)有关。

综上所述，含药血清体外对抑制肝癌细胞生长、促进肝癌细胞凋亡的作用较明显。本研究为含药血清用于肝癌的治疗提供了实验依据。

［1］Rockmann H，Schadendorf D.Drug resistance in human melanoma:mechanisms and therapeutic opportunities［J］.Onkologie，2003，26(6):581-587.

［2］谢长生，高文仓，陈陪丰，等.养阴清热方对615小鼠HCa-F肝癌凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax表达的影响［J］.中华中医药学刊，2007，25(11):2327-2329.

［3］Efferth T，Kahl S，Paulus K，et al.Phytochemistry and pharmacogenomics of natural products derived from traditional Chinese medicine and Chinese materia medica with activity against tumor cells［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(1):152-161.

［4］Masuda Y，Kawazoe N，Nakajo S，et al.Bufalin induces apoptosis and influences the expression of apoptosis-related genes in human leukemia cells［J］.Leukermia Research，1995，19(8):549-556.

［5］Park JH，Jin CY，Lee BK，et al.Naringenin induces apoptosis through downregulation of Akt and Caspase-3 activation in human leukemia THP-1 cells［J］.Food Chem Toxicol，2008，46(12):3684-3690.

［6］Wang CZ，Xie JT，Zhang B，et al.Chemopreventive effects of panax notoginseng and its major constituents on SW480 human colorectal cancer cells［J］.Int J Oncol，2007，(31):1149-1156.