枯草芽孢杆菌发酵产物杀虫作用的研究
2011-09-03杨旭升
余 琼 ，张 巍 ，杨旭升 ，杜 阳
（1.黑龙江大学生命科学学院微生物学重点实验室，黑龙江哈尔滨150080；2.黑龙江省科学院，黑龙江哈尔滨150001）
目前，植物病害防治主要依赖化学农药，化学农药在农产品的安全生产中做出了巨大贡献[1]，但化学农药的普遍使用和农药用量的增加产生了一系列问题，如病原菌产生抗药性、农产品农药残留超标，农田生态环境污染等问题。这些问题增加了农田生产成本，同时也使本身具有优良品质的农产品因农药的过度使用而受影响。新的防治技术和病害防治手段成为植保科技工作者探索的方向，其中利用枯草芽孢杆菌防治植物病害成为研究热点[2]。枯草芽孢杆菌是一种有益的土壤细菌，具有发达的分泌系统和较强的环境适应性，在农业生产中被广泛应用。枯草芽孢杆菌对多种病原菌具有拮抗性能，生产中用于防治多种植物病害[3-5]。例如用来防治芒果软腐病、辣椒炭疽病、苹果轮纹病、水稻纹枯病、水稻白叶枯病和一些镰刀菌引起的病害，相关研究比较深入，取得了显著的研究进展[6-10]。
由于生防微生物在田间条件下易受土壤温湿度、pH值、作物生长状况及土壤生态系统等微环境因素的影响，防治效果不稳定，用于大面积推广应用风险太大。因此，大多数枯草芽孢杆菌的生防研究总体上还处于实验室阶段[11-16]。为了解决这一问题，目前主要采用与化学农药复配防病和与其他拮抗微生物协同防病这两种措施。
与化学农药复配防病是通过使用化学药剂来帮助枯草芽孢杆菌克服在土壤生态环境里定殖的过程中与其它微生物群落竞争，从而形成优势种群，使之有足够的群体数量来克服包括病原菌在内的土壤习居微生物的排斥，保持其在植物根、叶周围定殖、分泌抗生素、诱导植物抗病性等作用，同时发挥化学药剂杀虫抑菌速度快、防治效果稳定的优势，通过复配协同作用达到优势互补、用量减少、防效增强的目的[16-21]。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和虫源
枯草芽孢杆菌由本实验室分离保存。
供试的虫种为菜青虫，黑龙江省科学院生物肥料研究中心室内常年累代饲养多代敏感虫种。
1.2 培养基
斜面培养基：LB培养基（蛋白胨10%，酵母浸粉5%，NaCl 5%，蒸馏水，pH值自然）。
种子培养基:蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化钠1%，自然pH值。
发酵培养基:蔗糖1%，蛋白胨1%,磷酸氢二钠0.2%，磷酸二氢钠0.2%，pH 7.0。
1.3 菌种活化
将保存的菌种转接到斜面培养基，37℃培养24h，备用。
1.4 种子液的制备
取一环活化的菌种，接入装量为50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，37℃，180 r/min培养18h。
1.5 摇瓶培养
取1 mL种子液，接入盛有50 mL发酵培养基的200mL三角瓶中（接种量为2%,V/V）。置摇床中，30℃振荡培养12h，转速为160 r/min，进行发酵。
1.6 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定
取培养好的斜面，用接种环挑3环接种于盛有50mL无菌种子培养基的250mL三角瓶中，采用摇瓶发酵培养条件振荡培养24h。自接种后每2h取样1次测定菌液的OD(600 nm),用未接种的培养基作为空白对照。
1.7 杀虫活性物质的酸碱稳定性测定
取发酵液10 mL进行杀虫实验，再用稀HCl或稀NaOH将其 pH值调至 2.0，3.5，4.0，5.0，6.5，8.0，9.5，11.0，静置24 h后，再调pH值为原发酵液的pH值6.8后，进行杀虫活性测定。
2 结果与分析
2.1 生长曲线的测定
生长曲线图见1，发酵培养0～2 h为枯草芽孢杆菌的生长停滞期，细菌数量极少;自2h以后进入对数生长期，菌体数量急剧增多;在12h达到生长高峰期，8～12h为枯草芽孢杆菌生长的稳定期，菌体生长缓慢。自12h后细菌数量开始减少，枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此，采用8～12h时的菌液作为菌种较合适，此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数。
图1 枯草芽孢杆菌的生长曲线Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis
2.2 杀虫活性物质的酸碱稳定性
枯草芽孢杆菌发酵液在pH值为2.0～11.0的条件下处理24 h后，进行杀虫性试验，试验结果见表1。
表1 发酵液经过不同pH值条件下处理后的杀虫活性对比表Table 1 Comparison of insecticidal activity of broth on different pH valueconditions
2.3 讨论
研究结果表明，枯草芽孢杆菌的杀虫作用主要有两种方式，一是造成细胞畸形，出现囊泡、肿胀，继而崩溃融解。二是对细胞壁的破坏，造成原生质从细胞壁融解处泄漏，以至消融。
3 结 论
通过实验可以得出枯草芽孢杆菌在不同的时间处在不同的生长时期，经实验分析得出枯草芽孢杆菌在8～12h为生长的稳定期，菌体生长缓慢。自12h后细菌数量开始减少，枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此，采用8～12 h时的菌液作为菌种较合适，此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数。
通过实验可以得出经不同的pH条件处理后，枯草芽孢杆菌发酵液的杀虫活性在64.7%～73.8%之间波动，整体波动不大；在pH 3.5～8.0的范围内，枯草芽孢杆菌发酵液的杀虫活性稳定在70%以上，在pH2.0、9.5及11.0处理后菜青虫的死亡率有所下降，但与原发酵提取液相比，仍保留原发酵液80%左右活性。说明该杀虫活性物质具有较好的pH值稳定性。
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