黑龙江省黑河市周边地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

2011-08-30朱少奇黑龙江省黑河市畜牧兽医局

中国乳业 2011年9期

文 / 朱少奇乔洁黑龙江省黑河市畜牧兽医局

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化学、微生物等因素的刺激所发生的一种炎症变化，是一种多因素疾病综合征。

奶牛乳房炎是目前危害奶牛养殖业的主要疾病之一，每年可造成巨大的经济损失[1]。虽然有多种病原微生物可引起奶牛乳房炎，但国内外公认的最常见、最主要的病原为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌和大肠杆菌等肠杆菌[2]。长期以来，牛场兽医对奶牛乳房炎的治疗以抗生素治疗为主，但常规抗生素治疗的结果并不理想。为进一步了解奶牛乳房炎病原菌的发展变化趋势以及设计具有针对性的治疗方案，本文对黑龙江省黑河市瑷珲区4 个规模化牛场的奶样进行了微生物学调查和药敏试验，以期为乳房炎的防治提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 奶样

以黑龙江省黑河市瑷珲区四嘉子乡、河南屯乡以及幸福乡的4 个奶牛养殖小区作为试验基地，选取隐性乳房炎（BMT阳性）或临床型乳房炎患牛发病乳区100 个，于采取治疗措施之前，对发病乳区乳头严格消毒，采集奶样（2 mL/乳区）至无菌管内。

1.1.2 培养基

犊牛血清、营养肉汤、营养琼脂、高盐甘露醇琼脂、7%羊血琼脂、麦康凯琼脂、MH 琼脂、氧化酶、马尿酸钠、山梨醇、七叶苷、生化管（成套）、微量发酵管，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3 标准菌株

金黄色葡萄球菌ATCC25923 （β溶血）、大肠杆菌ATCC25922，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4 药敏纸片

青霉素G、头孢噻肟、先锋V、先锋VI、阿米卡星、卡那霉素、四环素、环丙沙星、阿奇霉素、氨苄青霉素、链霉素，均购自哈尔滨生物制药一厂。

1.1.5 诊断试剂

隐性乳房炎诊断液（简称LMT），购自兰州中兽医研究所。

生1：我把几何图形分为两类，一类是立体的，比如：长方体、正方体、圆柱、圆锥、球、棱柱、棱锥等；一类是平面的，比如：正方形、长方形、圆、三角形等．

1.2 试验方法

1.2.1 奶样采集

选取隐性乳房炎阳性（经BMT对所选奶牛进行隐性乳房炎检测）乳区或临床型乳房炎乳区100 个。用75%酒精溶液消毒乳头孔处后，倾斜带无菌棉拭子的试管，将管口对准乳头孔，采集乳汁3～5 mL。采样过程严格无菌操作。

1.2.2 微生物分离培养

分别将无菌采集的隐性乳房炎或临床型乳房炎乳样摇匀，吸1 mL加入到10 mL含5%犊牛血清的营养肉汤中，同时用接种环无菌取样涂布于羊血琼脂平板，37 ℃培养24～48 h。将平板上的单个典型菌落（如未见菌落生长则用肉汤培养物接种到羊血琼脂平板，37 ℃ 培养18～24 h）分别接种到鉴别培养基中，37 ℃ 培养18～24 h 。观察菌落形态、生长特征，经革兰氏染色后进行镜检，并通过触酶、氧化酶试验进行纯检，初步判定细菌种类。

1.2.3 细菌生化鉴定

根据初步鉴定结果，对分离到的菌株有选择地进行生化试验。中等大小G-杆菌，接种于三糖铁培养基，再用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ—15e 进行生化鉴定；G+葡萄球菌按葡萄球菌属细菌生化编码鉴定管TH—16s进行生化鉴定；G+链球菌进行CAMP试验及链球菌生化鉴定，包括马尿酸钠水解试验，甘露醇、山梨醇和七叶苷发酵试验等。

1.2.4 药敏试验

药敏试验采用纸片扩散法，将经过鉴定的菌株各随机选择4 株，接种于营养肉汤纯培养液，37 ℃ 培养18～24 h ，滴加1 mL培养液于血琼脂平板表面，用“L”形涂布棒均匀涂布。待平板表面稍干燥后，用无菌镊子夹取抗菌药物纸片，按一定距离分别贴于平板上，置37 ℃ 恒温培养24 h 后取出，用游标卡尺测量各药的抑菌环直径。计算同一类菌不同菌株的平均抑菌直径。直径小于16 mm为不敏感，16～20 mm为中度敏感，大于20 mm为高度敏感。供试验药物为青霉素G、头孢噻肟、先锋V、先锋VI、阿米卡星、卡那霉素、四环素、环丙沙星、阿奇霉素、氨苄青霉素和链霉素。

表1 100 个奶牛乳房炎阳性奶样细菌鉴定结果

2 结果

2.1 细菌的培养特性和形态观察

在营养琼脂平板、血平板、高盐甘露醇琼脂平板上生长良好，菌落形态为圆形、湿润、突起、光滑、边缘规则的淡黄色小菌落；在血平板上见明显溶血；在麦康凯琼脂平板上不生长；在肉汤中浑浊、沉淀，并在管壁形成菌环；革兰氏染色为G+，呈葡萄串状、成双或单个排列的球菌，可初步判断为金黄色葡萄球菌。

在营养琼脂生长不良，在羊血平板上生长良好，可见圆形、灰白色、突起、光滑、较湿润小菌落，多呈β型溶血；触酶试验阴性，CAMP 试验阳性；革兰氏染色为链状、短链状或成双排列的G+圆型或卵圆型球菌，可初步判断为链球菌。

在营养琼脂平板上生长良好，形成圆形、乳白色、突起、光滑、较湿润中等大小菌落，麦康凯琼脂平板上呈红色；革兰氏染色为G-杆菌，可初步判断为大肠杆菌。

2.2 细菌生化鉴定

根据触酶试验、凝固酶试验阳性，参考《葡萄球菌属细菌生化鉴定编码册（TH-16s）》（杭州市天和微生物试剂有限公司）中规定的生化培养鉴定指标进行鉴定。触酶试验、凝固酶试验阳性，能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气，发酵甘露醇，硝酸盐、V-P阳性，溶血明显，可判断为葡萄球菌。

发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，不发酵山梨醇、棉籽塘；水解马尿酸钠、水杨苷、胆汁，不水解明胶、七叶苷；CAMP、吲哚试验阳性，V-P试验、甲基红、触酶试验阴性，可判断为无乳链球菌。

根据CAMP 试验结果，以及水解七叶苷（非发酵）和马尿酸盐的能力区分无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌。无乳链球菌不水解七叶苷（非发酵），水解马尿酸盐，CAMP 试验阳性；停乳链球菌不水解七叶苷（非发酵）和马尿酸盐CAMP试验阴性，非β型溶血；乳房链球菌的营养肉汤培养物呈均匀浑浊，能水解七叶苷（非发酵）和马尿酸盐，CAMP 试验阴性。

当镜检为G-杆菌，触酶试验阳性，氧化酶阴性时，接种麦康凯琼脂平皿、三糖铁琼脂斜面阳性后，根据《肠杆菌科细菌生化编码鉴定册（GYZ-15e）》（杭州市天和微生物试剂有限公司）中规定的生化培养鉴定指标进行鉴定，即在麦康凯琼脂平皿菌落为粉红色、V-P阴性、不分解尿素、构椽酸盐阴性、MR 和吲哚阳性，三糖铁产酸产气即可判断为大肠杆菌。

2.3 细菌分离鉴定结果

对100 个阳性乳样进行细菌分离培养和鉴定，结果见表1。从表1中可以看出，在75 份血清中检出10 种共89 个菌株，检出率为75%（75/100），其中葡萄球菌33 株，占37.1%；链球菌33 株，占37.1%；大肠杆菌9 株，占10.1%。从表1中可以看出，葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌是采样牧场引起乳房炎的主要致病菌。

2.4 药敏试验结果

对分离出的主要病原菌进行药敏试验，结果见表2。表2表明：病原菌基本上对青霉素G、链霉素产生耐药性；金葡菌对阿奇霉素、卡那霉素、头孢噻肟、先锋V、氯霉素高度敏感；表皮葡萄球菌对头孢噻肟、卡那霉素、阿米卡星高度敏感；无乳链球菌对氯霉素、四环素、阿米卡星高度敏感；停乳链霉菌对氨苄青霉素、卡那霉素、先锋VI、头孢噻肟高度敏感。乳房链霉菌和大肠杆菌只对环丙沙星和先锋V敏感。病原菌对本试验其余药物中度敏感。

3 讨论

从奶牛乳房炎病原菌分离鉴定结果可以看出，采样牧场引起奶牛乳房炎的主要病原菌是葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌。这与黑河周边地区奶牛养殖现状密切相关。饲料营养失衡、管理不善、栏舍潮湿、养殖小区卫生条件差、挤奶设备维护保养不及时或消毒不彻底都会引起乳房炎发生。因而，实际生产中应切实加强牛群饲养管理与挤奶设备的维护。

药敏试验结果显示，不同来源的分离菌株对头孢噻肟、先锋V、先锋VI、阿米卡星、卡那霉素、氯霉素高敏；但对四环素、环丙沙星、阿奇霉素、氨苄青霉素已出现耐药趋势；青霉素G、链霉素对所有菌株已几乎无效。以上结果，一方面表明了当前本地奶牛乳房炎的治疗首选药物主要有以上6 种；另一方面，由于抗菌药物的广泛应用，耐药菌株的数量愈来愈多[3]。在防治奶牛乳房炎时，临床用药要注意按规定的剂量与疗程使用，及时更换不同的敏感药物进行治疗，以免产生过多的耐药现象，不利于今后的治疗，而且还会影响人类用药及身体健康。■