Biolog生态板的应用原理及碳源构成

孔 滨，杨秀娟

（曲阜师范大学资产管理处，山东 曲阜 273165）

1 引言

在过去大量的研究中，SCU方法多是利用革兰氏阴性板（Gram-negative plates，简称GN板），该板由95种碳源组成，最早设计主要是用于细菌的鉴定［1］。之后，为了研究的需要，设计了生态板（Ecology plates，简称ECO板），ECO板有31种碳源，其中的6种碳源在GN板中没有，至少有9种是根系分泌物的组分，ECO板相对于GN板利用了更多生态有关的化合物，更适合于土壤微生物群落功能多样性研究，并且由于节省了碳源，每块板可以同时完成3个重复，降低了使用成本。

2 Biolog生态板研究环境微生物群落

2.1 微生物代谢中的氧化-还原反应

新陈代谢简称代谢，是生物体表现其生命活动的重要特征之一。代谢包括数以千计的不同酶的催化反应，这些复杂的酶促进有机反应的实现，多是经过反应部位的接近和取向的效应，形成过渡态而发生的。氧化-还原反应是生物代谢过程中的一类重要反应，其实质是电子的得失，电子从电子供体传递给电子受体。当代谢物被氧化，两个电子通常同时传递，并伴随着底物两个质子（H+）的释放。底物的氧化作用亦称作脱氢反应，其形式上等同于两个氢质子的释放［2］。列举一反应式说明其过程：

此反应中一个氢质子及一对电子从底物传递至吡啶环，另一个氢成为溶液中的质子。

2.2 四唑紫染料显色反应

四唑染色测定法于1942年由德国莱康（H.Lakon）教授发明，其原理是根据四唑盐类由原初氧化态转变为还原态时呈现明显的颜色（粉红色，紫色，红色，蓝紫色和蓝色）变化，来直接检测生化代谢活性。

氯化3-（1-萘基）-2，5-二苯基-2H-四唑鎓（Tetrazolium violet，四唑紫）是一种常用的四唑盐，在氧化-还原反应发生的基质脱氢（包括脱电子）生化反应过程中，四唑紫能够优先得到电子显示紫色，得电子越多，紫颜色越深。细菌代谢所需的能量主要是从生物氧化作用获得，生物学底物在生物体内氧化分解的过程，主要以脱氢和失电子的方式进行。因此，应用四唑盐显色法可以用来评价细菌的代谢活力。细菌利用碳源的能力越大，则紫色越深。四唑紫显色反应过程如下：

2.3 Biolog生态板的应用原理

ECO板上有96个微孔，每32个孔为1个重复，每板共计3个重复。32个微孔中除对照孔外各个孔内都含有一种不同的有机碳源和相同含量的四唑紫染料。将微孔内的有机碳源作为微生物的唯一能量来源，微生物接种到微孔板上的孔中后，若能利用碳源，即能够对其进行生物氧化，有电子转移，四唑紫就能优先俘获电子而变成紫色。颜色的深浅反映了微生物对相应碳源的利用能力。通过Biolog系统的微平板读数器，测定ECO板在590nm波长下的光密度值（OD值），完成数据的采集与存储。运用主成分分析（PCA）或相似类型的多变量统计分析方法展示不同微生物群落产生的代谢特征指纹（Metabolic Profiles）。其理论依据是Biolog代谢类型的变化与群落组成的变化相关［3］。

3 Biolog生态板碳源分类与性质

利用Biolog方法对不同研究对象进行测定时，产生的数据量非常大，为了充分挖掘隐含在实验数据中的信息，阐明不同微生物群落对不同碳源的利用差异，首先需要弄清ECO板的碳源结构，对微平板内31种有机碳源进行分类，为后续统计分析、解释实验结果作参考。

结合有机化合物化学官能团、微生物生理代谢途径和生态功能3个方面，将ECO板的31种碳源底物分为6大类［1］：糖类及其衍生物，羧酸，氨基酸，多聚物，酚酸类和胺类（表1）。

3.1 糖类及其衍生物

从化学结构讲，糖类化合物是多羟基的醛或酮。以多聚物形式存在的葡萄糖和其他糖类不仅是自然界矿化过程的主要物质，而且它们也以单体的形式存在，是大多数异养微生物重要的有机营养物。在ECO板中，将12种有机碳源归属于糖类及其衍生物中，并对其进行细化分类为7类。

表1 ECO板六类碳源

3.1.1 单糖及单糖磷酸酯

（1）D-木糖。在自然界较丰富，以多糖的形式存在于玉米芯、棉子壳、谷类秸秆中，是构成半纤维素的重要单体之一。

（2）葡萄糖-1-磷酸。磷酸化的葡萄糖是糖酵解途径的中间产物。

3.1.2 双糖

（1）纤维二糖是纤维素的二糖单位，水解后得到两分子的葡萄糖。微生物分解纤维素的酶具有可诱导性，但以葡萄糖为碳源的微生物产生的纤维素酶很少，如果加入以纤维素为主的底物可使其产生较多的纤维素酶。

（2）α-D-乳糖用酸或酶水解，得一分子D-半乳糖和一分子D-葡萄糖。这两种水解产物均能直接进入糖代谢。

3.1.3 糖苷

β-甲基D-葡萄糖苷是具有β-苷键的糖类衍生物，可由纤维素酶进行分解。

3.1.4 糖醇

将糖分子上的醛基或酮基还原成羟基，就成糖醇。糖醇具有某些糖的属性，是生物体的代谢产物。

（1）I-赤藓糖醇。广泛分布于水果、蘑菇、地衣等植物中。

（2）D-甘露醇。构成针叶材半纤维素的重要单体，是某些微生物的良好培养基。

3.1.5 糖酸

（1）D-半乳糖醛酸。构成聚半乳糖醛酸的构件分子，聚半乳糖醛酸是果胶物质的组分之一，主要存在于植物初生细胞壁和细胞之间的中层，在浆果、果实和茎中最丰富。

（2）D-半乳糖酸-γ-内酯。是醛糖酸形成的稳定分子内酯，为半乳糖的氧化产物，糖代谢途径的中间产物。

3.1.6 氨基糖

（1）N-乙酰-D-葡糖胺。它和D-乳糖反应形成的N-乙酰胞壁酸是细菌细胞壁结构多糖的构件分子之一。它也是几丁质、粘多糖、糖蛋白的单体之一。

（2）D-葡糖氨酸是D-葡糖胺氧化产物，属于氨基糖的衍生物。

3.1.7 D，L-α-磷酸甘油

在糖酵解过程中，中间产物类磷酸二羟丙酮在甘油磷酸脱氢酶作用下可还原生成α-磷酸甘油；后者可进一步被甘油-1-磷酸酶水解为甘油和单磷酸。可认为D，L-α-磷酸甘油参与了糖的代谢过程，故把其放到糖类及其衍生物这一大类中。可见Biolog生态板所选择的这些糖类及其衍生物很具有代表性，不但有常见的单糖和双糖，还选取了可以较全面涵盖不同种类的单糖的衍生物，这些都是聚糖的重要构件分子或者参与糖代谢的中间体。

3.2 氨基酸

氨基酸是土壤有机氮的重要组成部分，是植物根系向土壤介质中分泌的大量低分子有机化合物之一，微生物在生长代谢过程中，可利用氨基酸作为其氮源，合成植物生长调节剂，促进植物的生长［4］。

在ECO板中，选择了5种常见的氨基酸和1种较为简单的二肽。所选取的这5种较全面涵盖了氨基酸的不同种类，具有一定的代表性。其中L-丝氨酸和L-苏氨酸属于含羟基的氨基酸，L-天冬酰胺酸属于酸性氨基酸，L-精氨酸是碱性氨基酸，这4种都可归为脂肪族氨基酸；L-苯基丙氨酸是芳香族氨基酸的一种。甘氨酰-L-谷氨酸水解可生成甘氨酸和谷氨酸，二者分别为中性和酸性氨基酸。

3.3 羧酸及其衍生物

羧酸是植物根系分泌物的重要组分，目前已知有丁酸、柠檬酸、反丁烯二酸、苹果酸、丙酮酸、丁二酸等［5］。羧酸结构中可含有烯键、羟基、酮基、环氧基等。

3.3.1 酮酸

丙酮酸甲酯的官能团为羰基和酯基，属于羧酸衍生物，其水解产物之一的丙酮酸，和α-丁酮酸一样，都属于酮酸，为重要的代谢中间产物。酮酸是一类在生物体内有重要作用的有机酸，在氨基酸新陈代谢和维持氧化还原状态的过程中起重要作用。

3.3.2 羟基酸

（1）γ-羟基丁酸是一种效力强、快速作用于中枢神经系统的抑制剂。γ-羟基酸易形成内酯，γ-羟基丁酸形成的γ-丁内酯在许多天然物质和食品中都存在。

（2）苹果酸又名2-羟基丁二酸，是三羧酸循环中重要的中间产物，在苹果酸-天冬氨酸循环中也起重要作用。D-苹果酸是其一种右旋立体异构体。

3.3.3 不饱和酸

衣康酸学名为亚甲基丁二酸，是一种不饱和二元有机酸，可由微生物经发酵途径生成。

3.4 多聚物

3.4.1 α-环式糊精

α-环式糊精是淀粉经某种特殊酶水解得到的环状低聚糖，由6个葡萄糖基通过α-1，4-苷键结合而成。含有6个、7个或8个葡萄糖单位的相应称为α-、β-和γ-环糊精。环式糊精的环状结构，具有刚性，不易反应，对α-淀粉酶及β-淀粉酶有很大的阻抗性。

3.4.2 肝糖

肝糖又称糖原，相对分子质量约为2.7×105～1.0×108左右。糖肝可在细菌和个别植物中找到。

3.4.3 吐温40和吐温80

吐温的化学名称为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，简称聚山梨酯。根据山梨醇与高级脂肪酸所形成的酯的不同，吐温可有同类型的系列产品，如吐温40（棕榈酸酯）、吐温80（油酸酯）。吐温40中的棕榈酸为饱和脂肪酸，吐温80中的油酸为不饱和脂肪酸。在进行解脂微生物的分离时，可将吐温作为底物。例如：利用固体平板变色圈法，以吐温为底物，尼罗蓝（Nile blue）作为指示剂，根据变色圈大小来判断解脂细菌活性的高低。

3.5 酚酸类

3.5.1 2-羟基苯甲酸

2-羟基苯用酸又名水杨酸，存在于自然界的柳树皮、白珠树叶及甜桦树中。它有多种用途，是制染料、香料的重要原料，并可用作食物防腐剂。

3.5.2 4-羟基苯甲酸

4-羟基苯用酸也可称为对羟基苯甲酸，是小麦及其他作物根系分泌物和根茬腐解液中的主要化学成分，对大豆、花生、烟草等经济作物具有较强的化感作用，可导致作物产量降低、品质变劣、生育状况变差、病虫害发生严重等现象［6］。

3.6 胺类

氨分子里的氢被烃基或其它非酸性有机基团取代后衍生出的一类有机化合物。胺类大多具有碱性，能与酸结合成盐。胺在自然界中分布很广，其中大多数是由氨基酸脱羧生成的。

3.6.1 苯乙胺

苯乙胺是一种生物碱，具有鱼腥味。可由苯丙氨酸通过脱羧作用的方式生化合成。它可以在很多食物中找到。

3.6.2 腐胺

腐胺也被命名为1，4-丁二胺，是由生物的活体或尸体中蛋白质的鸟氨酸脱羧产生。是广泛存在于原核生物及真核生物中的生物活性物质。

4 主成分分析（PCA）方法及其在Biolog数据分析中的应用

ECO板的结构决定了Biolog试验获得的数据多，因此直观上很难比较各处理间存在的差异。为研究环境微生物对不同碳源利用能力的差异，从而达到全面了解微生物群落代谢功能特征的目的，研究者常用主成分分析法（Principal Component A-nalysis，PCA）进行分析。

4.1 阐述主成分分析法的原理

主成分分析的基本思想就是降维，用降维分析技术来解释原变量的协方差结构，即一种将原来众多且相关变量所蕴含的信息集中到少数几个相互独立的综合因子，所得的综合因子为原来变量的线性组合，保留了原始变量的主要信息（变异的主要部分），而且彼此之间不相关［7］。

对于一个有n个变量x1，x2，...，xn的多维空间，PCA方法可构造n个新变量，称为主成分得分（简称主成分）t1，t2，……，tn。主成分必须满足以下条件：每个主成分是各个原变量的线性组合；各个主成分之间为正交；经线性交换得到的t1的方差为最大，t2次之，依次类推，t1，t2，……，tn，称为第1，2，……，n主成分。一般而言，方差大的主成分含原变量的信息量大，因此t1所含原变量的信息量最大，t2次之，余类推。一般情况下，前面几个主成分的方差贡献率已足够大，可基本反映原变量的信息。这样原来多维空间的大部分信息可由前面几个主成分组成的低维（二维或三维）空间表现出来［8］。

主成分的基本性质［9］包括各主成分是相互独立的；由标准化原指标求主成分的系数就是各主成分相应的特征向量（Eigenvector）；主成分的方差是相关矩阵的特征根或特征值（Eigenvalue），即综合因子。在分析时只要由大到小选择前几个主成分分析其意义就可以。

某个主成分的贡献率（Proportion）=该主成分的方差／全部主成分的方差之和 ×100%；前P个主成分的累积贡献率（Cumulative Proportion）为前P个主成分贡献率之和。实际应用中，一般取累积贡献率为70%～85%或以上所对应的前P个主成分即可。主成分负荷量的大小和它前面的正负号直接反映了主成分与相应变量之间关系的密切程度和方向，系数的绝对值越大，说明该主成分受该指标的影响也就越大。

4.2 主成分分析法在Biolog分析中的应用

选取Gomez E［10］利用Biolog ECO板研究施有机肥对土壤微生物群落功能多样性的影响的实验，具体展现主成分分析法在Biolog数据分析中的应用。实验设3个处理：施农家堆肥（HSW），马和兔子粪肥（HRM），鸡粪肥（CM），并取未扰动土壤（C）作为对照。对实验数据进行主成分分析，过程如下。

（1）提取主成分。10Mg ha-1条件下提取的第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分别可以解释36.8%和12.1%原变量特征，20Mg ha-1条件下，PC1和PC2分别为38.8%和10.4%。

（2）利用PC1和PC2做出二维图形，直观表示各处理之间的差异。

（3）在统计软件出来的结果中找出与PC1和PC2具有较高相关系数的碳源，以明确造成二维图中差异的特征碳源基质。10Mg ha-1与20Mg ha-1条件下，与PC1相关性较高的碳源为D-半乳糖内酯、丙酮酸甲脂、D-木糖、吐温-80、D-甘露醇、4-羟基苯甲酸；与PC2相关性较高的碳源为α-D-乳糖。

5 结语

对研究者来说，Biolog方法要求的劳动强度、技术含量都较低，只需对Biolog微平板进行无菌接种操作即可，并且可以在较短的时间内检测较大量的样品。只要数据分析正确，培养时间合适，该方法在研究微生物群落功能多样性方面很有意义。在实际应用过程中，Biolog方法最好结合其他微生物生态学的研究方法（如DGGE和PLFA法）一起使用，以避免由于方法原理本身带来的偏差。

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