结肠癌中RASSF 1A基因启动子甲基化及其临床意义

王旭东,王海珠,徐 华,梁国栋,张 伟,朱宝平,房学东*,姜洪伟

(1.吉林大学第二临床医院普通外科,吉林长春 130041;2.长春中医药大学附属医院;3.内蒙古自治区医院）

本研究探讨结直肠癌组织中RASSF 1A基因启动子甲基化和mRNA表达异常与结直肠癌病理生物学特征的关系,为阐明抑癌基因RASSF 1A基因在结直肠癌发生发展中作用及其分子机理提供有力科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集我院2009年8月-2010年4月手术切除结直癌标本90例,均为腺癌,其中男性55例,女性35例,年龄42-78岁,平均62岁。组织来源和分组:分为三组(1）正常组;(2）癌旁组;(3）实验组。按:①分化程度:分为高、中、低分化组。②肿块大小:＞5 cm和 ≤5 cm。③临床分期:按照Dukes分期进行分组。

1.2 方法

1.2.1 RASSF 1A基因表达的检测:RT-PCR方法检测RASSF 1A基因mRNA表达。

1.2.2 设计引物:针对RASSF 1A基因启动子甲基化特异性PCR所设计的一组引物,使用引物设计软件Primer3,该引物包括甲基化(Methylated,M）与非甲基化(Unmethylated,U）特异性引物各一对,由宝生物工程(大连）有限公司合成。分别以M、U标记,各对引物上下游起始位点、扩增片断大小、引物序列如下:

甲基化引物设计:

M-上游引物:距转录起始点-43 bp至-17 bp

5′-CGTTGTTCGCGATTTTTGGTTTC-3′

下游引物:距转录起始点71 bp至92 bP

5′-ACCGATTACTTTAAAAATACGCG-3′

扩增片断:342 bp

未甲基化引物设计:

U-上游引物:距转录起始点-44 bp至-18 bP

5′-GTTGTTGTTGTTTGTGAITTTTGGTTTT-3′

下游引物:距转录起始点72 bP至99 bP

5′-CCACTTACCAATTACTTAAAAAATACACA-3′

扩增片断:351 bP

1.2.3 MSP测定DNA甲基化:按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 PCR产物行琼脂糖凝胶电泳:条件为2.5%琼脂糖凝胶,65 V恒压电泳1 h 40 min。0.1%嗅化乙锭染色15 min,凝胶成像系统照相分析。

1.2.5 检测甲基化位点状况 MSP产物6 μ l及DNA Marker 1 μ l用含有嗅化乙锭1.5%琼脂糖凝胶(稳压80V）在TBE电泳工作液电泳约20 min,后在紫外灯下观察结果,且用UVI凝胶成像系统摄影。

1.3 MSP结果的判断甲基化特异性引物扩增出产物,为完全甲基化;仅未甲基化特异性引物扩增出产物,为未甲基化;两对引物均扩增出产物,为部分甲基化[1]。

1.4 统计学处理所有数据均采用SPSS 16.0统计软件,组间比较用 χ2检验,P＜0.05有统计学意义。

2 结果

见表1、2,图1,2。表1可以看出,1）组和2）组比较,P=0.001,说明RASSF 1A基因启动子甲基化在癌组织和癌旁组织存在显著的差异,P＜0.05;1）组和3）组比较,P=0.008,说明RASSF 1A基因启动子甲基化在癌组织和正常组织存在显著的差异,P＜0.05.说明RASSF 1A基因启动子甲基化结直肠癌的发生发展有关。

图1 检测结直肠癌组织、癌旁组织及正常组织中总RNA琼脂糖凝胶电泳图

图2 MSP方法检测结直肠癌组织、癌旁组织及正常组织中RASSF 1A基因启动子甲基化状态癌旁组织和癌组织关系

表1 RASSF 1A基因甲基化与结直肠正常组织,

表2可以看出,按组织分化分组(高或中分化腺癌为一组,低或未分化腺癌为一组）,两组的甲基化频率差异有统计学意义(P＜0.05）。按浸润深度分组(T1-T2和T3-T4各为一组）,甲基化频率差异无统计学意义(P＞0.05）。按临床分期分组(A和B期和C和D期各为一组）,两组的甲基化频率差异有统计学意义(P＜0.05）。

表2 RASSF 1A基因甲基化与结直肠癌的关系

3 讨论

随着肿瘤研究的深人,人们发现除了DNA突变等遗传学改变外,基因甲基化和组蛋白乙酰化等不涉及DNA序列改变的表观遗传学机制在部分肿瘤的发生中可能起着至关重要的作用[2]。真核生物DNA甲基化水平与肿瘤关系密切,启动子区高甲基化能导致抑癌基因表达沉默,这是肿瘤发生的关键事件[3]。3p21等位基因缺失发现了一系列的从小到大的腺瘤的关系,尽管这样,这个关于3p21和RASSF 1A LOH得研究和总体的RASSF 1A基因改变一样,但是与一系列早期和晚期癌相关联,尤其是RASSF 1A基因片段的真实性[4]。RASSF1A基因定位于3p21,是Ras基因超家族的成员,发挥着抑癌基因的作用。与启动子的CpG岛甲基化的分析,RASSF 1A的启动子甲基化在早期结直肠癌组织中表达较多[5]。RASSF1A基因定位于3p2113,是Ras基因超家族的成员,发挥着抑癌基因的作用[6]。RASSF 1A基因改变破坏了细胞周期、分化、去分化、细胞凋亡之间的平衡,导致细胞无控制性生长。早期抑癌基因失活,随后各种癌基因激活[7]。

本研究得出结果是:癌组织组和癌旁组比较,P＜0.05,说明RASSF 1A基因启动子甲基化在癌组织和癌旁组织存在显著的差异;癌组织组和正常组比较,P＜0.05,说明RASSF 1A基因启动子甲基化在癌组织和正常组织存在显著的差异。高、中分化组和低、未分化组比较,两组的甲基化频率差异有统计学意义(P＜0.05）。T1、T2组 和T3、T4组比较,两组甲基化频率差异无统计学意义(P＞0.05）。A、B期组和C、D期组比较,两组的甲基化频率差异有统计学意义(P＜0.05）。

因此,RASSF 1A启动子区CpG岛的高频率的甲基化在结值肠癌的疾病发生中起着是非常重要的作用,RASSF 1A基因作为一个抑癌基因,该基因表达下降可能与结直肠癌的分化程度和浸润、转移情况密切相关,因此该基因在结直肠癌发病机制中的作用,成为结直肠癌的早期诊断以及预后判断的很关键的辅助手段,成为结直肠癌新的肿瘤标记物,而甲基化抑制剂也有望成为结直肠癌治疗的新方法。

[1]Mehlen P,Rabizadeh S,Snipas SJ,et al.The RASSF 1A gene product induces apoptosis by a mechanism requiring receptor proteolysis[J].Nature(1998）395:801.

[2]Prabhu JS,Korlim arla A,Banerjee A,et al.Gene specific methylation:Potentialm arkers for colorectal cancer[J].Int J Biol Markers,2009,24(1）:57.

[3]Hibi K,Nakayama H,Kodera Y et al.CDH13 promoter region is specifically methylated in poorly differentiated colorectal cancer[J].Cancer,2004,90(3）:1030.

[4]Norrie M W,Hawkins N J,Todd A V,et al.Inactivation of p16IN K4a by Cp G hypermet hylation is not a f requent event in colorectal cancer[J].J Surg Oncol,2003,84(3）:143.

[5]Van Engeland M,Roemen G M,Brink M,et al.K2ras mutations and RASSF1A promotermethylation in colorectal cancer[J].Oncogene,2002,21(23）:3792.

[6]Chen J,Rêcken C,Lofton2Day C,et al.Molecular analysis of APC promoter methylation and protein expression in colorectal cancer metastasis[J].Carcinogenesis,2005,26(1）:37.

[7]Noda H,M ash im a R,et al.Promoter hyperm ethylat ion of tum orrelated genes in sporadic colorectal cancer in young patients[J].J Exp C lin Cancer Res,2007,26(4）:521.