小孢子培养技术的芥菜育种应用研究进展

杨培新，郑钢勇，谢桂勉，李训仕，陈少雄，李海彬

（揭阳职业技术学院 应用生物工程系，广东 揭阳 522000）

小孢子培养技术的芥菜育种应用研究进展

杨培新，郑钢勇，谢桂勉，李训仕，陈少雄，李海彬*

（揭阳职业技术学院 应用生物工程系，广东 揭阳 522000）

综述了小孢子培养技术在芥菜育种中的应用研究.小孢子培养技术在芥菜育种应用受芥菜基因型、小孢子预处理、小孢子发育阶段、小孢子密度效应和培养基等因素影响.

芥菜；小孢子培养；影响因素

芥菜（Brassica juncea）是中国的特产蔬菜，为十字花科芸薹属一年生或二年生草本植物.芥菜作为异花授粉作物，在常规育种中，要获得性状稳定的后代一般需经过8～10代的性状选择，所需年限较长.对于二倍体作物，双单倍体育种是获得稳定性状后代的一条重要途径.在双单倍体育种中，可通过对F1进行花药培养或小孢子培养获得单倍体植株，然后经染色体加倍而产生纯合的二倍体植株.纯合二倍体植株的农艺性状不会发生分离，其基因型数远远少于F2的基因型数.另外，单倍体植株没有显性基因对隐性基因的掩盖干扰，若对其进行诱变育种，可有效提高突变育种的工作效率.以纯合二倍体植株作为育种材料，一般只需经过3代性状选择即可获得性状稳定的后代.

在芸薹属作物中，来自德国的Liche[1]首次报道利用油菜游离小孢子培养获得再生植株后，目前已在该属的甘蓝型油菜种（B.napus）[2-3]、埃塞俄比亚芥种（B.carinata）[4]和芸薹种（B.campestris）[5]等各品种中建立了游离小孢子培养方法.将小孢子培养技术应用于芥菜育种，可缩短纯化芥菜品种所需的时间，提高芥菜的育种效率.随着对芥菜生理生化的深入研究与探索，小孢子培养技术在芥菜育种中的应用取得了一定的进展.

1 小孢子培养体系的理论基础

小孢子的正常发育途径是形成花粉或成熟的雄配子体.当正常的发育途径遇到阻碍时，早期的小孢子将进行有丝分裂而形成愈伤组织或胚状体，最后发育成孢子体.因此，小孢子培养是通过抑制小孢子的正常发育途径，加强交替途径，促使细胞全能性表达的一个过程.

2 小孢子培养体系的建立

小孢子培养是将植物的小孢子直接从花药中分离出来，接种到液体浅层培养基中进行培养，使小孢子启动脱分化并发育成愈伤组织或单倍体胚，进而发育成完整植株的一种技术.该技术不仅可以提高育种效率和单倍体植株的生产效率，还可为离体诱变育种、原生质体培养与融合、外源DNA导入以及遗传学、胚胎学等研究提供理想的培养体系.

小孢子培养技术体系包括对供体植株的基因型、小孢子发育时期、小孢子预处理、培养基、初始培养的高温处理、密度效应等有关因素进行研究探索与优化处理.

2.1 基因型

研究表明，在芸薹属植物中，材料的遗传背景影响其小孢子培养，不同基因型的材料胚状体产量存在显著差异[6].余凤群等[7]对130份甘蓝型油菜材料进行小孢子培养，获得胚状体的材料有35份，占接种材料的26.92%.芥菜的基因型也影响着其小孢子培养中的胚胎产生能力[8].刘冬等[9]利用7种基因型芥菜进行研究，发现各基因型小孢子胚胎发生能力存在很大差异，各基因型均观察到细胞分裂，6种基因型获得了小孢子胚，其中3种基因型得到了再生植株.

2.2 小孢子发育阶段

花蕾中的小孢子发育是异步的，每个药蕾中存在不同发育阶段的小孢子.在小孢子培养中，小孢子的发育阶段影响着胚状体的发生，最佳发育阶段为单核晚期，形态观察表现为单核靠边期.花蕾大小反映小孢子发育进程，也是小孢子发育时期的外部形态标志，因此，可通过花蕾大小来间接选择小孢子发育时期.刘冬等[9]以芥菜品种“成都大头菜”为材料，分别比较不同长度（2.O、2.5、3.0、3.5 mm）的花蕾小孢子胚胎发生能力.结果表明：长度为3.0 mm的花蕾时，小孢子胚胎发生率最高；细胞学观察显示，花蕾长为3.0 mm时的花药中绝大部分小孢子处于单核晚期.Ali等[10]以油用芥菜品种BARI Sarisha 11为材料，发现当长度为3.0～3.1 mm的花蕾时，小孢子胚胎发生率最高，每皿产生胚状体多达7个.Parihar等[11]通过对比2～7 mm的花蕾长度，发现2～3 mm为小孢子培养的最佳长度.陈玉萍等[12]研究了包心芥菜花蕾内的花瓣长约为花药的1/2和花瓣长与花药长大约相等时的花蕾对小孢子培养中胚状体形成的影响，结果发现仅从花瓣长度为花药长度1/2的花蕾里获得少量的胚状体.不同研究者的结果不一至，说明小孢子发育时期与花蕾大小的关系受材料基因型的影响，在芥菜的小孢子培养中，应根据研究材料作相应探索与研究.

2.3 低温预处理

低温预处理也是小孢子培养的一个关键因素，适宜的处理温度和处理时间可改善小孢子代谢活动，有利于小孢子适应离体后的培养环境，促使小孢子正常生长.王淑珍[13]认为雪里蕻小孢子（分蘖芥的一个变种）以4℃预处理48 h为宜，Ali等[10]以6℃为低温预处理，发现最佳处理时间为4 d.

2.4 热激处理

初始培养温度对芸苔属植物小孢子胚胎发生的诱导极为重要，当小孢子接种到培养基上后，需要高温条件来启动分裂和改变小孢子的定向发育过程，即从配子体发育方式变为孢子体发育方式.Keller W A等[14]在芸薹属研究中，发现温度对胚状体发生的重要作用，认为温度对胚状体发生频率的影响在小孢子培养的早期阶段，并且在甘蓝型油菜花药培养中首次采用32-35℃高温处理，提高了花粉胚的诱导率和胚状体的产量.虞慧芳等[15]和Ali等[10]分别在32.5℃和32℃下对雪里蕻和油用芥菜进行热激暗培养2 d，并获得胚状体.

不同温度处理对芥菜小孢子胚胎产生的影响不同.刘冬等[9]在25、30、33、35 ℃下对芥菜小孢子进行热激处理3 d，结果只有33℃的处理有小孢子胚形成.热激处理时间长短对芥菜小孢子胚胎发生也有影响.刘冬等[9]发现33℃处理3 d的效果明显好于处理2 d.Prem等[8]以25℃为对照组，对比32.5℃处理5 d和32.5℃处理直到出现心型胚为止（10～15 d）的热激培养，后者产生更多的胚状体，并发现32.5℃的热激处理超过15 d时，对胚状体的形成产生不利影响.

2.5 小孢子密度

培养基中小孢子密度影响胚状体产量.陈玉萍等[12]采用1个花蕾/mL、2个花蕾/mL、3个花蕾/mL的不同密度研究包心芥菜小孢子密度对小孢子培养的影响，结果发现1～2个花蕾/mL的密度的培养效果较好.Parihar等[11]对比小孢子培养密度的影响，发现最佳浓度为10 000个/mL.

2.6 胚状体诱发培养基

2.6.1 培养基

已有研究表明，芥菜的小孢子培养最佳培养基为NLN培养基.Prem等[8]研究了NLN-13，Sato和KA三种不同培养基对油用芥菜小孢子培养的影响.结果发现，最佳培养基为NLN-13培养基，在Sato培养基上没有胚状体出现，在KA培养基上只有极少的胚状体出现.Parihar等[11]和Ali等[10]都利用NLN培养基对油用芥菜进行小孢子培养，虞慧芳等[15]和王淑珍[13]均使用NLN培养基对雪里蕻进行小孢子培养，并获得胚状体.

另外，在油菜小孢子培养中，采取换液培养可提高胚再生频率，相同基因型在不同的培养液及不换培养液的条件下胚状体的产生有明显差异[16].

2.6.2 活性碳

在油菜小孢子培养中，向诱导培养基加入活性炭可吸附小孢子培养过程中排放的有害物质，改善小孢子的发育环境，增加子叶期胚的产量，有利于胚的两极正常发育和减少畸形胚的形成[17].活性炭对芥菜小孢子胚状体的影响随不同的供体材料、不同的研究者结果不尽相同.虞慧芳等[15]和王淑珍[13]均在含活性碳的NLN-13培养基成功诱导出雪里蕻胚状；Parihar等[11]发现在NLN培养基中添加活性碳具有促进胚状体发育的作用，但不能提高其产量；而Prem等[8]报道在NLN-13培养基中加活性碳对胚状体的形成生产不利影响.

2.6.3 激素

在油菜小孢子培养中，激素对胚状体发生的影响随激素的种类和不同供体材料反应不一致.因材料不同，适量加入不同激素可提高胚状体产量，但激素可能并不是形成小孢子胚状体的必需条件.有研究认为，在NLN培养基中添加6-BA[17]、2,4-D[18]以及6-BA和2,4-D[18]的配合对油菜小孢子胚胎的发生有促进作用.但石淑稳等[19]、余凤群等[7]研究表明，2,4-D和NAA有时表现促进作用，有时表现负作用，IAA不起作用，6-BA则可显著提高胚产量.也有报道认为，激素在某些基因型小孢子胚的诱导过程中是不必要的[20]；不含激素的NLN培养基有利于胚启动和胚质量的提高[21]，其培养效果最好[22].

在芥菜培养中，胚状体发生可以不需要激素，在不加激素的NLN-13培养基可成功诱导产生芥菜胚胎体[11-13，15].Prem等[8]发现在NLN-13培养基中加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、6-苄基（6-BA）对胚状体的形成生产不利影响，而添加10μL的AgNO3有利于胚状体的形成.

2.6.4 蔗糖浓度

培养基中蔗糖除了起碳源的作用外，还起调节渗透压的作用，对于小孢子的启动和胚状体的发生有促进作用.刘冬等[9]利用4种蔗糖浓度（7%、10%、13%和16%）处理，发现芥菜品种“成都大头菜”在10%蔗糖浓度的NLN-82培养基中胚胎发生率最高，小孢子胚产量为1.9胚/蕾.Parihar等[11]发现NLN培养基的最适蔗糖浓度为13%，Prem等[8]、陈玉萍等[12]、虞慧芳等[15]和王淑珍[13]均在蔗糖浓度为13%的NLN培养基中成功诱导出芥菜胚状体.

2.7 胚状体的分化成苗

经暗培养获得的胚状体发育到子叶期时，应及时转移到固体培养基上进行光照培养，以诱导幼苗的形成.陈玉萍等[12]在培养过程中发现，将包心芥菜子叶期胚状体移到附加0.1 mg/L 6-BA的B5固体培养基上，置于25℃每天16 h光照下可诱导其胚状体分化成苗；并发现当将胚状体移到固体培养基上时，胚状体越大，越容易分化，越早形成正常的幼苗，胚状体越小，分化越迟，越难以形成小幼苗.刘冬等[9]利用13%蔗糖的MS琼脂培养基，在6 000 Lx，14 h/d光照，22℃下继续培养诱导胚状体分化成苗.虞慧芳等[15]将雪里蕻的子叶期胚状体于B5固体培养基（B5+0.5 mg/L BAP+0.1mg/L GA3+0.5 mg/L KT，pH 5.8）上进行弱光培养20～30 d获得小幼苗.王淑珍[13]在雪里蕻的鱼雷后期，将胚状体移入1/2浓度MS固体培养基中，25℃下光培养诱导幼苗的形成.已有结果表明，芥菜胚状体的分化成苗阶段对培养基适应能力较强，可在多种固体培养基中进行分化成苗.

2.8 再生植株染色体加倍

油菜离体培养的单倍体自然加倍现象普遍存在于离体小孢子细胞分裂、胚胎形成、植株营养生长和生殖生长时期各阶段[3]，但频率较低.单倍体加倍通常采用秋水仙碱处理，秋水仙碱处理后的小孢子再生植株中双单倍体率明显高于自然加倍[2，23].目前，在芥菜的小孢子培养中，大部分仅针对小孢子胚状体的诱导进行研究，而对植株染色体的加倍研究较少.刘冬等[9]在芥菜“成都大头菜”小孢子再生株染色体倍性分析中发现有80%的再生植株经染色体组自然加倍形成双单倍体，认为在芥菜小孢子胚胎发生过程中，染色体组自然加倍是比较普遍发生的细胞学现象.

3 展望

芥菜是我国的特产蔬菜，目前其育种手段以常规育种为主，严重地制约着品种的选育和生产.小孢子培养技术是一条高效、安全的育种新途径，能快速地从大量的群体中获得具新性状的种质材料.以小孢子培养技术体系为技术研究平台的单倍体育种手段将是提高芥菜育种及生产效率的重要途径，可为芥菜新种质的创建和新品种的快速选育提供新的思路和方法.但目前对芥菜小孢子培养技术体系的探索与研究较少，还没有建立起完善、稳定的培养技术体系，更是难以将小孢子培养技术应用于芥菜育种中.由于影响小孢子培养的因素众多，只有进一步深入研究，不断完善芥菜小孢子培养技术体系，才可望将这一技术迅速应用于芥菜的遗传育种实践中.

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Research Progress of Microspore Culture in Mustard（Brassica juncea）Breeding

YANG Peixin，ZHENG Gangyong，XIE Guimian，LI Xunshi，CHEN Shaoxiong，LI Haibin＊
（Bioengineering Department of Jieyang Vocational&Technical College，Jieyang522000，China）

The application of microspore culture in mustrard（brassica juncea）were summaried in this paper.The pre⁃vious results indicated that the application of microspore culture in mustard was affected by the genotype of donor plant,the previous treatment of microspore,the microspore development stage,the microspore density,the culture medium and so on.The perfect and steady Microspore culture has not been constituted in Mustrard.The breeding process would be improved by constituting perfect Microspore culture in Mustrard.

Mustard（Brassica juncea）；Microspore culture；Influencing factors

S 336

A

1674-4942（2011）01-0077-04

2010-11-23

广东省科技计划项目农业攻关项目（2009B020420001）

*通讯作者

黄 澜