饲料中霉菌毒素的分析方法进展

2011-08-15

中国乳业 2011年8期

霉菌毒素常常发生在饲料和食品中，是由真菌产生的有毒、小分子次生代谢产物，包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧血腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、伏马毒素等，对人类和动物存在潜在的危害。虽然很难除去人类食品和动物饲料中的霉菌毒素，但可以通过监测食品和饲料中的霉菌毒素来降低其对人类和动物的危害，特别是监测饲料中的霉菌毒素。科学家们进行了大量的研究，试图建立更加灵敏、准确、简单的方法来检测霉菌毒素。本文主要阐述目前检测霉菌毒素方法的发展趋势和几个重要的在饲料中常发生的霉菌毒素的检测方法。

1 霉菌毒素分析的常用方法

霉菌毒素的检测方法很多，但由于霉菌毒素的化学结构和物理化学特性复杂，在样品中分配不均和基质的干扰，使其分析更加复杂。饲料的样品基质对霉菌毒素的影响最大，因为饲料是由多种物质混合在一起的，不同的物质中的霉菌毒素检测的程序是不同的。通常，首先要对怀疑被污染的物质进行严格的样品处理，从样品中提取毒素，分析之前再进行洗脱除去杂质的干扰。在实际的分析中，有些方法可直接进行分离和定量，有些方法在分离和定量之前需要对霉菌毒素进行衍生。

有些霉菌毒素具有一个荧光特性的发色基团，如黄曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素（OT）、玉米赤霉烯酮（ZE），样品的提取物经常用薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）来分离结构相似的化合物和污染物。通过比较样品和标准品色谱的比移值（Rf）和保留时间来定性霉菌毒素，通过荧光强度和吸光度来定量霉菌毒素。一些霉菌毒素含有单端孢霉烯团，最大吸收值还不清楚，通常用气相色谱和气质联用色谱进行检测。这些样品在提取后，上样之前通常需要进行柱前衍生。TLC和HPLC的方法对单端孢霉烯团有效，但对黄曲霉毒素的敏感性和特异性不强。TLC对谷物中的脱氧血腐镰刀菌烯醇的检测限是50～100 μg/kg。

2 霉菌毒素分析的发展趋势

2.1 提高采样和质量控制

霉菌毒素的分析步骤较多，每一步都有可能造成误差，霉菌毒素分析的变异系数（CV）大于30%是很普遍的。因此，霉菌毒素分析技术的提高应主要从以下几方面入手：①简化分析程序、尽可能缩短分析步骤；②减少基质干扰，提高定量步骤的敏感性和特异性；③优化样品制样，减少制样误差。美国规定了被黄曲霉毒污染的花生的制样粒径，欧洲几国也作了规定，要求样品制样必须少量多样。美国的花生工业制定了一个连续的计划，即通过降低不一致获得相同的目标化合物。随着更简单、更精确、更昂贵的筛查和定量方法的发展，使用多样品而不是一个量大的样品来分析更加实际。样品的转运过程，尤其是在进入实验室分析之前，应避免在样品收集过后产生霉菌毒素，造成制样误差。

提高质量控制的另一个重要方面是使用质控物质。Van Egmond等人研究发现，检测花生中的黄曲霉毒素时，分析产生的主要误差来源于前处理时不完全提取和霉菌毒素的损失，当加入质控物质同时分析样品时，分析方法准确度得到提高。Sharman等人在一个新方法评估中了使用质控物质，同时使用了免疫亲和色谱和柱-高效液相色谱方法分析花生奶中的黄曲霉毒素，方法的准确度和精确度都得到了提高。

2.2 使用极性溶剂提取霉菌毒素和使用柱分离样品

使用有机溶剂提取霉菌毒素的花费高，而且大家越来越认识到有机溶剂的毒性，开始使用毒性小、价格低的极性溶剂，如水和甲醇、水和乙腈。另外，可使用高容量，更加有效的填充小柱代替硅胶和硅酸镁载体大柱，免疫亲和色谱柱也可作为霉菌毒素的前处理工具。这些新方法不仅节约了有机溶剂和分析时间，而且更加有效。尽管新的样品的提取方法有所发展，但对于一些新的检测方法来说，如免疫测定方法和质谱测定方法，这一步骤可完全省略。对一些液体样品，如尿、牛奶等，提取、洗脱和浓缩可一步完成。

2.3 色谱技术的提高

虽然薄层色谱法没有什么明显的进步，但这一方法在霉菌毒素分析中被普通采用。预涂布（色谱）板是为高效薄层色谱法和反向薄层色谱法板商品化制造的，使用HPTLC板比传统的薄层色谱板好，这是由于分析时可使用较少的溶剂。Bardburn等对谷物中黄曲霉毒素的几个检测方法进行比较研究，发现采用双向HPTLC联合苯基相方法净化AF，回收率和精确度都提高。Bell等用HPLC、HPTLC、ELISA检测花生酱中的AF，发现HPTLC比ELISA方法得到的数据更稳定和变异系数更低。

HPLC方法在霉菌毒素（含有荧光和发色基团）检测中的应用始于19世纪70年代中期，使用化学吸收物质有效地填充柱子，检测器的效率、灵敏度和重现性均得到了较大提高。可见，HPLC检测霉菌毒素是一种非常有效的方法。

使用极性溶剂作为萃取溶剂和简化洗脱程序成了一种趋势，在分析霉菌毒素如AF、OT、橘霉素、棒曲霉素、霉菌毒素的单端孢霉烯（TCTC）等时，使用反向的色谱柱也是一种趋势。如AFB和AFG在经过半缩醛衍生转化后，荧光强度加强，AFB2a和AFG2a这两个衍生物比AFB和AFG极性更高，更适合用反向色谱柱分离。因此HPLC是分析AF及其衍生物最常用、最有利的方法，即用反向C18柱进行分离，用荧光检测器进行定量。因而，这个程序包括分离、定量和确证。1990年，HPLC检测谷物和花生制品中的AF被美国官方农业化学家协会首次采用。

其他检测方法，如常规相柱层析硅胶分离后AF用碘/溴柱后衍生，或者反相柱采用柱前衍生的方法，荧光强度也得到有效提高。OT和ZE用碘溶液柱前衍生没有提高荧光强度。然而氨溶液作为柱前衍生试剂能加强OT的荧光强度。Francis等研究发现，在分析谷物中的AF时，β-环式糊精能加强其荧光强度。

除了AF和OT采用HPLC柱后或柱前衍生外，其他霉菌毒素如柄曲霉素、含有TCTC和烟色基团的霉菌毒素，没有发色和荧光基团的，也采用该方法检测。如烟曲霉毒素含有1 个氨基基团和几个羧酸基团，邻苯二甲醛荧光试剂常用作衍生化试剂来增强其荧光强度。

随着可见光-紫外多波长的发展，如光电二极管整列检测器和多通道二极管整列检测器，联合计算机的搜索能力，可以实现色谱柱分离后对整个化合物的光谱图进行监测，结果得到了更进一步的确定。激光荧光法和同步荧光法在HPLC方法中也被使用起来提高检测器的灵敏度。

大量的分析样品需要检测，就需自动化AF检测方法的实验步骤，在线分析、浓缩的自动化，免疫亲和色谱柱作为净化步骤，HPLC定量分析，使得HPLC分析霉菌毒素进入了一个新时代。

气相色谱（GC）、毛细管超临界流体色谱-负离子化学电离质谱法也用来检测霉菌毒素，对含有单端孢霉烯（TCTC）基团的霉菌毒素GC检测方法仍然是最有效的。

2.4 质谱方法的新发展

在早期的调查中，质谱没有考虑作为霉菌毒素的定量方法。随着质谱的分辨率和计算机搜索能力的的提高，质谱在霉菌毒素的定量和确定上得到了新发展。

2.4.1 高分辨率的质谱

高分辨质谱化学电离方法常常产生1 个正离子或1 个负离子，强调产生1 个分子离子作为黄曲霉毒素的分析。场解吸质谱和快速原子轰击和电力方法一起被应用。

2.4.2 气相色谱质谱法

随着GC-MS的应用，每个化合物可选用3个离子进行质谱扫描。而且这种方法能检测μg/mg级甚至更小的霉菌毒素，但还是存在相同的保留时间其他物质的干扰。

2.4.3 串联质谱

该方法目前已被广泛使用。第一步是质子分离，从基质中选择目标化合物，如分子离子、质子化分子、分子负离子。第二步是用目标气体如氩气碰撞活化解离，母离子和子离子被用来分析。与选择性模式相比，串联质谱的监测系统叫多反应监测。Uyakual等使用GC串联质谱对AF进行了检测。

2.4.4 液相色谱质谱法

随着仪器的发展，可将质谱和液相色谱联合起来测定霉菌毒素，如高速原子冲击法、热喷雾、等离子体喷雾、动态的原子轰击质谱测定法，联合LC已经运用在多种霉菌毒素的分析上。

2.5 生物分析的提高

霉菌毒素生物分析的进展也得到了提高，用来检测鳃足虫、老鼠纤维原细胞培养、幼鼠肾细胞中的含TCTC基团的霉菌毒素等。液式细胞计检查在测定20 份不同的霉菌毒素和毒性真菌提取物中小鼠骨髓瘤细胞NS-1的生存能力时是有效的。然而，大多数生物分析既不灵敏也不特效，仅仅用来作为扫描一般毒素的一种手段。

3 免疫化学发展的加强

为了克服在化学和生物分析中遇到的困难，免疫化学方法得到了发展。因为霉菌毒素不是一种抗原，研究重点放在它们需要与蛋白质和多肽键合在一起，在兔子和其他动物里产生多克隆抗体。随着杂种瘤细胞技术的发展，针对多种霉菌毒素的单克隆抗体也制备出来。随后，多种免疫分析方法，如放射性免疫测定法（RIA）、酶联免疫法（ELISA）和其他几种比较先进的免疫化学扫描方法也用于检测霉菌毒素。这些方法都很灵敏、特效、操作简单。特效抗体已经被制备成免疫组织化学染色试剂并作为提取工具的免疫亲和柱。可见，免疫分析在霉菌毒素分析中得到了广泛运用。

在讨论不同类型的免疫分析过程之前，必须考虑以下几个重要的标准：①因为大多数霉菌毒素的免疫分析存在着有毒样品和无毒样品键合竞争的问题。因此，对于抗体分子的特殊键合位点，除了在分析中有特殊的抗体外，还要有一个好的霉菌毒素标记；②对于精确定量，分离毒素的自由基和键合形式是很重要的；③抗体交叉反应（特异性）和结构类型变化较大，在分析中应熟悉抗体的特异性；④样品中结构相似的化合物的存在，与抗体发生反应是可能的。因此，在实验前，应该检查基质。以下描述的大多数免疫分析，样品没有净化。样品从固相基质中提取后，用合适的缓冲溶液稀释后，直接进行分析。然而，在适当的的洗脱后，灵敏度有所提高。

3.1 放射免疫

放射免疫程序是将特殊抗体、未知样品溶液或已知标准品和一系列的标记毒物一起培育，在自由基和键合毒物分离后，测定片段中的放射强度，样品中霉菌毒素的浓度通过和标准品比较而被确定。放射性标记物的特殊活性对实验方法灵敏度非常重要。放射免疫方法能够检测到样品的ng级甚至更低。放射性免疫法在提取或使用高活性的标记物后通过净化能够提高灵敏度。虽然放射性免疫检测法检测霉菌毒素能得到精确的数据，但因涉及放射性物质的使用，主要用于研究性实验。

3.2 竞争ELISA法

有2 种酶联免疫测定法可用来检测霉菌毒素即使用霉菌毒素—酶键合物的直接ELISA和使用霉菌毒素—蛋白质键合物和键合了酶的键合物的间接ELISA，辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶常作为键合酶使用。

3.3 快速扫描检测方法

在间接和直接竞争ELISA方法中，通过缩短培养时间，调整酶和抗体的浓度，在一定浓度水平快速测定样品，其原理和ELISA的原理相同。该方法反应时间大大缩短，约需10～15 min。Dewey等利用单克隆抗体建立了快速扫描方法检测稻粒中的岛青霉。另一种扫描方法是免疫亲和方法，应用于有荧光的霉菌毒素，如AF和OT的检测。其过程是先用免疫亲和柱洗脱，再用荧光检测器检测其浓度。

4 化学分析和免疫化学检测方法互补

4.1 免疫亲和色谱为化学分析提供净化工具

1977年Sun等首次将免疫亲和柱应用于RIA检测方法，后来用于测定尿和牛奶样品中的AFM。该方法早期主要用于生物液体中，后来大量用于AF的检测，包括固体样品。大量研究表明该方法对AF的净化非常有效。免疫亲和柱和柱后衍生化试剂联合应用检测日用品中的AF已经成为官方方法。Carmen等采用自动控制的免疫亲和柱净化牛奶中AF并测定其含量。

4.2 免疫亲和色谱

ELISA作为HPLC的柱后监测系统用于分析含TCTC基团的霉菌毒素。该类毒素首先被反向C18柱分离，分离出的霉菌毒素进行ELISA分析。这种方法不仅能确定含TCTC基团的霉菌毒素，而且能够进行定量。低浓度的T-2毒素、相关的单端孢菌素及其代谢物也能通过这种方法检测。已证明HPLC和ELISA联合分析TCTC霉菌毒素是有效、灵敏、特异的。同样，ELISA和TLC联合也可用于分析霉菌毒素，即先通过TLC初步提取，然后用ELISA分析。