实时荧光PCR技术在手足口病原学检查中的应用

王七生，秦金勇，蒋立立

桂林市疾病预防控制中心检验科，广西桂林 541001

手足口病是肠道病毒引起的急性传染病，具有流行性强、传染性强、传播途径复杂等特点，好发于儿童（5岁以下），手足口病较常见的病原体是柯萨奇病毒A16型（CoxA16）和肠道病毒71型（EV71）[1-2]。近年来该病呈现出了新的特点：①发病高峰期明显提前；②全国高发地区区域扩大，且发病强度高于往年；③发病90%以上为5岁以下儿童，托幼儿童和散居儿童大约各占一半；④实验室确诊的病例大多数是EV71型，危重患儿病例增加。这为及早、迅速和准确地检测确定手足口病原体传染性疾病的治疗与预防提出了更高的要求。本文采用实时荧光PCR技术，对桂林市妇女儿童医院确诊的手足口病患儿进行肠道病原学进行鉴别与分析。现将实验报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

样本来源于桂林市妇女儿童医院，2010年临床确诊为手足口病的患儿，共40例，诊断依据卫生部发布的《手足口病预防控制指南》（2008 版）[3]。 年龄 0.75～10.00 岁，平均 3.15 岁。均使用肛拭子法采集患儿粪便标本，共计40份样本，样本均按照《手足口病预防控制指南》的要求进行采集储存及转运操作。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 样本采集使用肛拭子法，用无菌棉签采集患儿的粪便，放于病毒汉格氏液保存管，冷藏运至实验室，-20℃保存，取上清200 μl用于提取病毒RNA[4]。

1.2.2主要试剂及仪器 本实验室用荧光PCR仪器为美国ABI公司生产，型号为7500。所用分光光度计为美国Varian生产的Cary50Probe紫外光度计。所用超速离心机为德国Eppendorf生产。试剂盒包括提取RNA的试剂盒等均购于北京金豪生物有限公司。

1.2.3 检测试剂 肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，适用于EV71、柯萨奇病毒的核酸筛查，柯萨奇病毒A-16核酸检测试剂盒（CVA-16）适用于柯萨奇病毒A-16病毒核酸的特异性检测；肠道病毒71型核酸检测试剂盒（EV71）适用于肠道病毒71型核酸的特异性检测[4-5]。引物及探针信息：EV-Com引物（上游）：5’-GTG TGT CGT AAC GGG CAA CTC-3’；EV-Com 引物（下游）：5’-TTT CAA TTG TCA CCA TAA GCA GC-3’；EV-Com 荧 光 探 针 ：5’-ACC GAC TAC TTT GGG TGT CCG TGT TTC C-3’；CVA-16 引物（上游）：5’-CCA TTG GTG CTC CCA CTA CA-3’；CVA-16 引物（下游）：5’-GCT TCA GTG TTG GCA GCT GTA G-3’；CVA-16 荧光探针：5’-CTG TGA ACA ACC AAG TAA ACC GCT CC-3’；EV71 引物（上游）：5’-CAG AAC ACA CAG GTG AGC AGT C-3’；EV71 引物（下 游）：5’-GCG TGT CTC AAT CAT ACT CTC ATC-3’；EV71 荧光探针：5’-CCA GCA CTC CAA GCT GCT GAA ATT GG-3’。

1.2.4 实时荧光PCR检测 肛拭子法提取并处理的40份样本，按照试剂盒说明书操作，首先使用Trizol法提取标本的RNA，然后在扩增仪上将萃取得到的RNA进行扩增，最后根据PCR试剂盒提供的优化方法进行退火温度、离子浓度、探针浓度、引物浓度等优化处理，并建立标准曲线[6-7]。标准曲线建立方法即：将阳性标准品置于260 nm紫外光下进行吸光度测定，以计算出DNA的拷贝数。并分别连续10倍稀释且进行荧光PCR检测以获得标准曲线，且经重复性、敏感性检测。所有操作完成时间为3～4 h。

1.3 统计学处理

将实验数据建立Excel数据库，采用SPSS 18.0统计学软件分析，计量资料采用非参数秩和检验。P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 样本标准曲线

用10倍倍比稀释的标准模板作定量标准曲线，CVA-16标准曲线相关系数分别为r=0.914，曲线斜率为-3.167；EV71标准曲线相关系数分别为r=0.952，曲线斜率为-3.382；EVCom标准曲线相关系数分别为r=0.964，曲线斜率为-3.386。线性相关性良好。PCR扩增效率为94%，说明PCR反应对模板的扩增很完全。

2.1 肛拭子标本的实时荧光PCR检测结果

40份肛拭子标本通过前述3种核酸检测试剂盒的实时荧光PCR检测，检测结果：肠道病毒通用型核酸检测试剂盒（EV-Com）阳性为22例，柯萨奇病毒A-16核酸检测试剂盒（CVA-16）阳性为9例（占22.5%），肠道病毒71型核酸检测试剂盒（EV71）阳性为12例（占30%），其中CVA-16或EV71阳性，都同时为EV-Com阳性。EV-Com阳性病例的肛拭子标本采集时间为起病后1～7 d，发病3 d的肛拭子样本EV-Com阳性病例占75%。

3 结论

实时荧光PCR是一种核酸定量技术，具有普通PCR的高灵敏性[8]，已经成为肠道病毒诊断的重要手段。本研究中采用实时荧光PCR方法，严格按照检测试剂盒说明书操作，对利用肛拭子法采集的共40份标本进行了病毒Cox A16和EV71的核酸检测。结果CVA-16标准曲线相关系数分别为r=0.914；EV71标准曲线相关系数分别为r=0.952，柯萨奇病毒A-16核酸检测试剂盒（CVA-16）阳性为9例，肠道病毒71型核酸检测试剂盒（EV71）阳性为12例，结果与有关文献相似[9]。研究发现手足口病病毒检出率与标本的采集时间相关性，发病前3 d的肛拭子样本进行检查更利于病原学检出。而CVA-16和EV71肠道病毒还是手足口病的主要病原体，实时荧光PCR技术对手足口病的病原诊断具有重要价值，它操作简便，稳定性良好，重现性好[10]，可以在3～4 h内获得检测结果，可以作为手足口病肠道病毒的快速检测方法，为临床及时采取救治方案提供一种早期诊断依据[11]。

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