心律宁片剂中氧化苦参碱的萃取及其含量测定的研究

高洪燕 张 咏

黑龙江省医院药剂部，黑龙江哈尔滨 150036

苦参为豆科植物苦参的干燥的根，具有清热燥湿、杀虫止痒，利尿等功能。其有效成分生物碱含量较高，主要为：苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱等20余种。大多数单碱对多种类生物（如真菌、细菌、线虫、昆虫、哺乳动物包括人类）有多方面的生物活性。尤其近年来发现的抗癌而又增强免疫力等独特的药理作用为医药界所瞩目。

在超临界CO2流体萃取（CO2-SFE）中，由于处于超临界状态下的CO2流体兼顾液体及气体的传质特点，且超临界CO2流体萃取的特性和极性还可以通过调节萃取压力、温度、加入不同品种的夹带剂等因素方便的调节，从而使超临界CO2流体萃取显示了快速、提取效率高、选择性好等特点[1]，中药中的生物碱等极性偏大，加大压力后，CO2流体的密度和解电常数增大，极性增强：加入夹带剂也可有效地增大流体的溶解性能，促进成分的溶出[2]。本实验用76%的乙醇作为夹带剂对苦参中的氧化苦参碱进行提取。并用高效液相色谱法，以YWG-NH2为固定相，乙腈-无水乙醇-磷酸水溶液为流动相，测定氧化苦参碱的含量，现将实验结果介绍如下。

1 仪器和试剂

FY221-50-60型超临界萃取装置（哈尔滨市天宇科技开发有限公司）；美国WATERS高效液相色谱仪；600高压双泵；2996二极管阵列检测器；7725i定量进样阀；Millenium 32系统软件。

氧化苦参碱对照品由中国药品生物制品检定所提供；中药材由黑龙江省绥化市药品检验所提供；检定乙腈为HPLC级；水为纯化水；二氧化碳（99.99%）由市化工厂提供；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YWG-NH2，250 mm×4.6 mm，10μm，流动相：乙腈∶无水乙醇∶水（80∶10∶10，磷酸调pH=2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；用外标法检测。

2.2 超临界CO2流体萃取的条件

2.2.1 碱化试剂的选择 生物碱在植物中多数以盐的形式存在，若直接用极性较弱的溶剂提取，往往提取不完全，所以在提取前需先碱化，使之全部转化为游离碱，碱化剂可采用Ca（OH）2、三乙胺或氨水，由于Ca（OH）2不易溶于水，且易产生杂质，而三乙胺对萃取槽的腐蚀性也较大，故本实验采用氨水作为碱化剂，以投料量的二倍量浸泡过夜。

2.2.2 萃取压力的选择[3]物质处于其临界温度（Tc）、临界压力（Pc）以上时，成为单一相态，称为超临界流体。所以考察压力对提取率的影响，必须选择临界压力以上的压力。在超临界流体中，压力越大，则流体的密度越大，萃取的能力越强，但对于杂质的萃取量也随之增加。CO2的临界压力为7.534 MPa。而在提取生物碱时，35 MPa和42 MPa样品的提取率间有非常显著的差异，但随提取压力的增加，杂质的提取率也有增加，所以选择42 MPa为本实验的萃取压力。

2.3 氧化苦参碱的提取

苦参干粉末投料300 g，加0.1 mL/L氨水600 mL浸泡过夜，次日投入萃取釜中，于45℃、CO2流量0.70 nm3/h连续萃取。萃取过程中分3次加入夹带剂约200 mL，1.5 h后第1次收集萃取液，以后每隔0.5 h收集一次，直到无萃取液产生。整个萃取过程约为2 h，收集萃取液约100 mL，其上层为浅黄至棕黄色透明液体，底部有少许棕黄色沉淀。

2.4 萃取液中苦参碱及氧化苦参碱的总含量测定

2.4.1 线性范围 贮备液制备：精密称取氧化苦参碱对照品2 mg，置25 mL量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释至刻度，摇匀备用。线性范围：精密量取上述贮备液 0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、4.50 mL置10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，按上述色谱条件进样10μL，记录峰面积，以对照液浓度（C）与其相应峰面积（A）A=277762.0C-10870.0，r=0.9994，线性范围为 0.4 ～ 0.5μg/mL。

2.4.2 精密度实验 取线性方程中1、2、4号对照品，分别进样5μL，测定其峰面积，计算 RSD（n=5）分别为 0.9%、1.1%、1.7%。

2.4.3 加样回收率 精密量取6份萃取液1 mL，分别加入储备液0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，以滤膜过滤，分别进样5μL，测量峰面积，计算加样回收率平均为98.72%，RSD=3.2%（n=6）。

2.4.4 样品测定 精密量取萃取液1 mL，转移至10 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，以滤膜过滤，即得供试液，平行制样5份。取上述溶液各5μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以外标法计算氧化苦参碱含量。样品色谱图及对照品色谱图，结果表明5份样品的氧化苦参碱含量平均值为4.82%，RSD=2.13%。

2.4.5 稳定性实验 取线性方程中1、3、5号对照品，分别间隔1 h进样5μL，测定面积，计算变异系数RSD（n=5）为1.7%。隔日再取上述样品进样，计算日间变异系数RSD（n=5）为1.2%。上述结果表明，氧化苦参碱其日内日间均表现良好稳定性。

3 讨论

在夹带剂的选择中，常用的有乙醇、甲醇、苯等有机溶剂，考虑到生物碱易溶于有机溶剂，以及乙醇对仪器的腐蚀性最小，因此实验前拟定乙醇为夹带剂。并根据参考文献[4]选取4种浓度的乙醇溶液（95%、80%、76%、70%）作为夹带剂分别进行实验性验证，结果表明，以76%浓度的乙醇作为夹带剂的提取率均高于其他3种浓度的乙醇作夹带剂时的提取率，与文献一致。

苦参中的生物碱主要有苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱等20余种[5]，其中苦参总碱占到全部生物碱的3%～5%。且在苦参的冷浸出液中，以氧化苦参碱为主，而加热或煎煮可能使氧化型碱转化为相应的非氧化型碱。由于在超临界CO2流体萃取中，提取温度不高，温度变化范围小，且提取条件稳定，因此对于提取率标识物的确定，选择了氧化苦参碱。

在本实验中，对于苦参中氧化苦参碱的提取时间为2 h，消耗有机溶剂为200 mL，氧化苦参碱提取率为4%～5%，其各项数值均优于传统的回流萃取法，充分显示了超临界CO2流体萃取的科学性。仅对超临界CO2流体萃取的重要因素如夹带剂、萃取温度、萃取时间、萃取压力进行了考察。而影响超临界CO2流体萃取的因素还有很多[6]，如分离压力、CO2的流量及夹带剂的流量等。且超临界CO2流体萃取的条件决定了它特别适合于提取脂溶性成分，而利用超临界CO2流体萃取生物碱的应用并不广泛，各种条件尚在探讨之中，因此，利用超临界CO2流体萃取法提取各种生物碱有待于更进一步的研究。

[1] 庞树和，田葳，潘淑明.HPLC法测定心律宁片（苦参总碱片）中苦参碱和氧化苦参碱的含量[J].中医药信息，2002，19（1）：15-17.

[2] 向柏，孙英华，张媛，等.RP-HPLC法测定苦参总碱中苦参碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱 [J]. 中草药，2005，36（12）：16-19.

[3] 艾雄，曾三平.高效液相色谱法测定当归苦参丸中苦参碱和氧化苦参碱[J].中南药学，2007，5（2）：9-11.

[4] 章育中，张淑蓉，崔建芳，等.苦参及其制剂中生物碱的薄层分离和含量测定 [J].药学学报，1981，10（4）：9-12.

[5] 张宝恒，申军.抗心律失常中药的研究进展[J].中成药，1981，9（5）：26-28.

[6] 庞树和，田葳，潘淑明.HPLC法测定心律宁片（苦参总碱片）中苦参碱和氧化苦参碱的含量[J].中医药信息，2002，5（1）：52-53.