ING4基因与肿瘤研究新进展﹡

潘 旋 王朝霞

南京医科大学第二附属医院肿瘤科，江苏南京 210011

生长抑制因子蛋白家族（inhibitor of growth family，ING）是一组重要的肿瘤抑制因子，有INGl～ING5这5个家族成员，这五种基因共编码包括INGl基因的3种产物（INGla、INGlb、INGlc）以及ING基因家族其它4个成员的编码蛋白[1-3]的7种蛋白。ING4作为一种新的候选抑癌基因，近年来它的抑癌功能及其机制受到越来越多的关注，本研究就ING4基因与肿瘤的研究进展作一综述。

1 ING4基因

ING4最初于2002年从人的脑垂体中被分离出[4]，其编码的蛋白定位于细胞核内，在人类所有被检测到的组织中均有表达[5]。该基因跨度为13 kb，定位于人类染色体12p13.31，至少包含8个外显子，Genebank中有两个不同一个编码248个氨基酸的mRNA转录本，编码249个氨基酸的mRNA转录本，两个转录本的不同可能是由于ING4的不同剪切方式而形成的，一个在131-132位氨基酸为K（赖氨酸）、G（甘氨酸），另一个在131-132位合并为一个S（丝氨酸）[6]。ING4蛋白与ING家族其他成员在N端和C端上具有高度的同源性。它的C端有一个植物同源结构域（planthomeodomain，PHD）[7]，此结构域是磷脂酰肌醇磷酸的核受体功能结构域，通过与磷脂酰肌醇磷酸信号分子相结合，能够调节细胞存活、生长与增殖[1-2，8]。N端是一个核定位信号序列（nuclear localization sequence，NLS），此结构在帮助ING4蛋白的核定位以及与p53在细胞核的复合定位中起着重要的作用[9-10]。

2 ING4基因异常与肿瘤的发生

2.1 ING4基因表达异常与肿瘤的发生

Garkavtsev I等[5]采用RT-PCR实验方法发现，恶性程度低的神经胶质瘤中ING4 mRNA的表达水平较正常脑组织低2～3倍，而高度恶性的胶质母细胞瘤中ING4 mRNA的表达水平较正常脑组织低6倍。另外，用免疫组织化学的方法检测到胶质瘤中ING4蛋白的表达水平明显低于正常脑组织，而且随着胶质瘤恶性程度的增加，ING4的表达水平也相应降低。曹芳等[11]研究发现乳腺癌组织与良性乳腺增生组织中ING4蛋白表达有明显的统计学差异，证明ING4蛋白表达缺失与乳腺癌的发生相关。Wang等[12]通过检测50例肺癌组织中ING4 mRNA和蛋白表达水平，发现ING4在肺癌组织中较癌旁正常肺组织显著低表达，且ING4的表达水平与肺癌的病理分期及淋巴结转移情况负相关，推测ING4的下调与肺癌的发生和发展有关。

microRNA（miRNA）可通过和靶mRNA的3’非编码区（UTRs）互补配对，在转录后水平负性调控转移相关基因的表达从而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭转移[13]。Zhang等[14]发现ING4基因是miR-650下游直接的靶基因，miR-650的表达在胃癌组织中显著上调，而ING4则显著下调，由此笔者推测，过表达miR-650促进胃癌细胞的增殖可能是通过靶向抑制抑癌基因ING4实现的。Li等[13]运用组织芯片的技术分析101例原发性黑色素瘤活检组织，结果显示，ING4基因在恶性黑色素瘤中的表达水平明显低于发育异常的痣，ING4的表达水平与黑色素瘤的厚度、溃疡形成密切相关，是预后差的分子标志物之一。ING4基因在头颈部鳞癌中表达也显著下降，且与头颈部鳞癌的低分化状态、TNM分期负相关[14-15]。

2.2 ING4基因突变与肿瘤的发生

Gunduz M等[15]采用RT-PCR实验方法发现，在9个肿瘤细胞株中，包括神经母细胞瘤细胞株（IMR-32、SK-N-AS、SKN-BE）、非小细胞癌细胞株（H23）、小细胞肺癌细胞株（H82）、乳腺癌细胞株（T47D）和结直肠癌细胞株（ACHN）7个ING4基因发生了突变。12个核苷酸的缺失是最普遍的突变，包括一组NLS其编码序的列。SK-N-AS细胞株发生单核苷酸465C缺失，H82细胞株单核苷酸446A缺失，缺失的结果导致移码突变，产生截短的基因产物，在近一半的缺失中包含PHD区，这两种单核苷酸缺失变异不仅产生无功能的蛋白，并且使野生型等位基因产生的正常的ING4蛋白受到抑制。另外，ING4基因的突变还有包括H82和ACHN细胞株在内的错义突变。而Gundus等[15]采用RT-PCR和cDNA测序法分析50例头颈部鳞癌标本中ING4基因的突变情况，没有发现任何变异。

3 ING4基因的作用机制

3.1 增强p53基因的活性

组蛋白乙酰化转移酶复合物（HAT）在氨基酸残基乙酰化中起重要作用，P300为其中的一个成份，ING4与P300亚基相结合是Shiseki M等[1]通过免疫共沉淀反应发现的。因此，ING4基因可以通过控制p53乙酰化状态来调节p53的功能，使p53的转录活性增强，肿瘤的发生即被抑制。ING4定位于细胞核内是通过核定位信号（NLS）与p53结合来完成的，当NLS区域发生突变时，ING4不能与p53蛋白结合，从而不能够上调p53蛋白活性发挥抑制肿瘤的功能[10]。

3.2 恢复细胞间接触抑制

Kim等[15]等研究发现，在体内ING4可抑制由原癌基因MYC或MYCN过度表达引起的细胞间接触抑制的丧失，在肿瘤细胞株中，ING4突变可使其接触抑制的功能失活，ING4影响MYC下游靶基因的转录被认为是可能的作用机制，因为在MYC诱导的接触抑制丧失中靶基因起直接作用。

3.3 抑制肿瘤侵袭转移

肿瘤恶变的重要因素之一是血管增生，而肿瘤生长和转移却要依赖新生血管形成。在Garkavtsev I等[5]的研究中，在小鼠大脑中分别植入ING4基因表达量高与低的人类神经胶质瘤U87MG细胞株，用活体显微镜观察小鼠大脑中血管的变化，结果发现植入ING4基因低表达的肿瘤细胞株后，与对照组相比，血管数量和血管密度均比较高，出血更频繁，且肿瘤细胞长势更快。这些结果均说明ING4能抑制血管的生成进而抑制肿瘤的生长。

Li J等[13]发现ING4基因过表达的黑色素瘤细胞中张力丝的形成减少，MMP-9、MMP-12的活性下降，过表达ING4基因能够抑制黑色素瘤细胞的侵袭、转移。在后续的研究中，Li等[18]又发现ING4通过抑制NF-кB/IL-6通路影响黑色素瘤新生血管的形成，并且ING4基因是转移抑制基因BRMS1下游的靶基因，BRMS1可能通过ING4基因发挥抑制肿瘤转移的作用。

进一步研究发现，ING4基因能够与核转录因子NF-кB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）结合，抑制NF-κB调节基因如 IL-8、MMP-9、COX-2 等的转录[5，16]。这些基因在肿瘤新生血管的生成及肿瘤转移的过程中发挥重要的作用。ING4对这些因子的转录抑制并不是通过直接阻碍NF-κB活化，细胞核定位以及与DNA的结合，相反，ING4与NF-κB蛋白同时结合到这些基因的启动子区域，出现p65亚基磷酸化、HAT中p300亚基和乙酰化组蛋白的下降，进而上调此启动子区域组蛋白去乙酰化转移酶（HDAC）的活性来抑制该基因的转录。另外，Klironomos等[20]运用免疫组化的方法分析101例星形细胞瘤中ING4、NF-κB的表达水平时，发现ING4与p65的表达呈显著负相关。因此ING4可能通过影响IL-8、MMP-9、COX-2的表达抑制肿瘤血管的生成及肿瘤生长。

3.4 ING4抑制HIF的活性

低氧诱导因子 -1（hypoxia—inducible factor-1，HIF-1）目的基因中包含许多与葡萄糖代谢和糖酵解相关的酶，它调控着葡萄糖转运蛋白及糖酵解酶等[17]。在缺氧状态下，肿瘤细胞通过HIF上调这些酶的表达，使细胞适应缺氧状态[18]。低氧时HIF的上调是肿瘤生长过程中重要的促进因素，所以抑制HIF的活性可以抑制肿瘤的生长，提高肿瘤治疗的疗效。Ozer等[19]研究证实ING4能与低氧诱导因子（HIF）脯氨酰羟化酶的铁依赖性氧化酶直接发生作用，通过ING4的募集反应来调节HIF的活性。进一步研究发现，ING4能够明显抑制缺氧状态下HIF靶基因（如Nip3、AK3等）的表达。

3.5 抑制肿瘤细胞生长

Shiseki M等[1]在结肠癌RKO细胞株中高表达ING4基因，发现：RKO细胞克隆形成能力下降，S期细胞数量的减少以及G0/S和G2/M期细胞数量的增加，p53下游p21蛋白表达增加，并且这一过程是p53依赖的。而Zhang等[20]研究显示，ING4诱导的p2l的上调可以增强细胞周期调节蛋白Bl（cyclin B1）和p2l的结合，启动细胞G2/M周期阻滞，最终抑制细胞的增殖，且这种抑制呈剂量依赖性。此外，在胰腺癌中也观察到此类现象，ING4过表达诱导S期细胞比例下降，G2/M期细胞数上升[21]。这些结果表明ING4可能通过p53依赖的方式，影响细胞周期的进程，进而抑制肿瘤细胞的生长。但Kim等[15]则认为ING4对细胞增殖没有直接的抑制作用，而是通过恢复细胞间的接触抑制，间接抑制肿瘤细胞的生长。

MicroRNA（miRNA）可通过和靶mRNA的3’非编码区（UTRs）互补配对，在转录后水平负性调控转移相关基因的表达从而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭转移[26]。Zhang等[27]发现ING4基因是miR-650下游直接的靶基因，miR-650的表达在胃癌组织中显著上调，而ING4则显著下调，由此我们推测，过表达miR-650可能是通过靶向抑制ING4基因，促进胃癌细胞的增殖。

3.6 ING4基因诱导细胞凋亡，增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性

Klironomos G等[20]用外源性ING4基因感染人肝癌细胞株HepG2，并用细胞毒药物阿霉素和鬼臼乙叉甙处理HepG2细胞，通过检测亚G1期细胞凋亡数来评价ING4基因化疗增敏作用。结果发现ING4能提高HepG2细胞对阿霉素、鬼臼乙叉甙的化疗敏感性，并呈现剂量依赖方式。阿霉素治疗组（阿霉素+ING4）较对照组（阿、霉素）敏感性提高3倍，鬼臼乙叉甙治疗组（鬼臼乙叉甙+ING4）较对照组（鬼臼乙叉甙）敏感性提高4～4.6倍。Xie等[22]则证实ING4能够提高肝癌细胞株SMMC-7721对抗癌药顺铂的敏感性，在肝癌细胞中过表达ING4基因影响内源性和外源性凋亡通路中的重要因子，如Fas、Bcl-2、Bax、caspase-3等，这些研究为肝癌的联合治疗方案提供了新的理论依据。田玥等[23]还发现ING4能增加胰腺癌细胞对持续低剂量率γ射线的敏感性，两者联合应用后胰腺癌细胞凋亡数明显增加，生长明显抑制。

Zhang等[30]首次证实miR-214和miR-15在胰腺癌组织中异常高表达，过表达miR-214可降低胰腺癌细胞对化疗药吉西他滨的敏感性，并且ING4基因是miR-214的一个靶基因，miR-214靶向抑制ING4的表达可能介导胰腺癌细胞对吉西他滨敏感性的下降。

综上所述，ING4在肿瘤发生、发展中起重要作用，能抑制肿瘤生长，抑制肿瘤血管生成，诱导细胞凋亡，增加肿瘤的放化疗敏感性，是一种新的重要肿瘤抑癌基因，随着对ING4基因研究的不断深入，将有助于进一步认识ING4的生物学功能及其对肿瘤的调控机制，为肿瘤的基因治疗及分子靶向治疗提供新的依据及靶标。

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