血管内皮抑素抑制淋巴管生成和淋巴结转移的作用机制

马兴群 宋 勇

淋巴结转移是恶性肿瘤进展的标志之一，越来越多的证据认为肿瘤新生淋巴管形成和淋巴结转移之间有密切关系。了解调节淋巴结转移和淋巴管生成的信号通路，有可能成为抑制肿瘤生长的新方法。近年来，陆续有报道认为血管内皮抑素(endostatin，ES)有抑制肿瘤新生淋巴管生成和淋巴结转移的作用，但其机制尚未完全明确。现将相关研究进展作一综述。

一、肿瘤新生淋巴管形成和淋巴结转移在肿瘤研究中被忽视的原因

肿瘤细胞发生转移是多数肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞发生转移的机制很多，包括肿瘤细胞侵犯局部组织、淋巴道转移、血行播散等。长期的临床和病理学观察发现，淋巴管道转移是肿瘤细胞发生播散的主要途径［1］。伴有多发性淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas，SCCs)患者，5年生存时间与无淋巴结转移患者比较，分别是26%和75%［2］。新生淋巴管形成常在胚胎期、组织损伤、炎症、寄生虫感染、肿瘤等情况下发生［3］。过去10年中对肿瘤新生血管形成的分子机制有了深入的研究，而对淋巴管形成和转移在肿瘤中的重要作用一直被忽视，其原因之一可能是缺乏特异性分子标志物来区分血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞，其次，对调节淋巴管生长的特异性生长因子也缺乏了解［1，4］。

二、淋巴管结构以及晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)表面的细胞因子及受体

淋巴管尾端是个盲端结构，表面被覆单层内皮细胞，细胞之间有不规则间隙，孔隙较大，细胞间连接和紧密连接稀疏分布。毛细血管被覆双层内皮细胞，细胞间密布紧密连接，循环周细胞丰富，而起始淋巴管的周细胞分布较少或者缺如，细胞膜不完整，细胞骨架借助弹性蛋白丝与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)相连［5］。透明质酸(hyaluronan，HA)是ECM的主要成分之一，HA与白细胞以及肿瘤细胞表面的CD44跨膜受体相互作用，为白细胞迁移和肿瘤细胞向远处淋巴结转移提供通道［6］。在LECs表面有特异性分子标志物:淋巴管内皮透明质酸受体抗体LYVE-1(lymphatic vessel endothelial HA receptor)，调控早期淋巴管生成的同源基因Prox-1及肾小球足突细胞膜粘蛋白受体podoplanin［3-4］。LYVE-1是最近发现的HA受体，仅在LECs上有高度表达，参与淋巴细胞归巢和肿瘤细胞迁移。分子结构与CD44高度相似，但是CD44分子在LECs几乎没有表达，因LYVE-1与CD44功能相似，能与可溶性和不可溶性的HA结合，用免疫电子显微镜检查，LYVE-1的管腔结构具有淋巴管的超微结构特征，LYVE-1是目前罕为人知的淋巴管特异性分子标志物之一［6］。此外，在LECs表面有VEGF-C的表达，该因子是VEGF家族中的成员之一，能激活VEGFR-3［4］。开放的细胞连接和淋巴微孔是肿瘤细胞入侵的门户，肿瘤细胞可诱导新生淋巴管生成。既往认为只有在肿瘤原发部位和癌旁会有新生淋巴管形成，即肿瘤诱导新生淋巴管(tumoral lymphangiogenesis)形成。肿瘤细胞是以渗透或者栓子形式，通过体内已经存在的成熟淋巴管达到前哨淋巴结并发生远处转移，而并不是通过新生淋巴管道转移的。近年发现在区域淋巴结尤其是被肿瘤细胞侵犯的前哨淋巴结附近也有新生淋巴管形成，这一现象被称为淋巴结诱导淋巴管形成(lymph node lymphangiogenesis)。这些淋巴管不断生长并为各级淋巴结转移提供额外通道，新生淋巴管生成和淋巴结转移相辅相成，促进肿瘤细胞转移［7］。类似于血管生成调节方式，淋巴管生成也受到淋巴管生成因子以及淋巴管生成抑制因子的精细调控。LECs表面有多种细胞因子及受体的表达，1996年Eola等［8］发现VEGF-C与VEGFR-3结合，可能在淋巴管生成过程中起到调节作用。越来越多的实验证明，VEGF-C是调节淋巴管生成以及淋巴结转移的主要因子［1，4，9］。肿瘤细胞能诱导VEGF-C高表达，促进淋巴管生成以及淋巴结转移［1，4］。过表达VEGF-C的转基因小鼠，对肿瘤原发灶增值的作用不明显，但是却显著地增加前哨淋巴结附近的淋巴管增生，而野生型小鼠，不能诱导LECs从主静脉发出以及淋巴管形成［3，4］。因此，抑制VEGF-C表达有可能达到抑制癌细胞经淋巴系统转移，进而为辅助抗肿瘤治疗提供新的治疗方法。

三、ES抑制肿瘤新生淋巴管生成和淋巴结转移的经典分子机制

1997年O’Relly在鼠血管瘤细胞株的培养上清中分离得到的一种血管生成抑制因子，它可以抑制内皮细胞的增殖和迁移，并诱导内皮细胞凋亡，测序发现它是源于ⅩⅤⅢ胶原蛋白C-末端的水解片段，是以胶原蛋白ⅩⅤⅢ为前体切割而来，并命名为ES［10］。ES在多种肿瘤动物模型中能抑制肿瘤生长和血管生成，未出现毒性及耐药性［11-12］。近年发现ES和淋巴结转移以及淋巴管生成之间有密切联系。Nikolaos等对315例1991年2月至1999年7月之间的SCCs原发病灶和转移性淋巴结的石蜡标本进行免疫组化，多发淋巴结转移(N+)的SCCs原发病灶缺乏角化和淋巴细胞浸润，细胞核呈高度多形性，淋巴结转移附近有丝分裂相明显增加，ES蛋白和ⅩⅤⅢ胶原蛋白的表达较无淋巴结转移者明显下调，ES蛋白在原发病灶和多发淋巴结转移之间的表达无明显差异。无淋巴结转移的SCCs患者3年和5年生存期明显延长，表皮角化程度较高［2］。这一研究结果提示ES可能有抑制淋巴结转移和新生淋巴管生成作用，并能改善SCCs的分化，提高角质化程度。高表达ES的J4转基因小鼠，与野生型小鼠相比，血清中ES含量高1.6倍，能明显改善化学致癌物诱导的皮肤癌分化，降低肿瘤恶性度和侵袭力。皮肤鳞状细胞癌和良性乳头状瘤小鼠，在各不同时间点，LYVE-1+淋巴管密度都明显降低，淋巴结转移率显著下降。第34周的乳头状瘤小鼠，VEGF-C的表达较对照组下降7倍，VEGFR-3含量下降15倍，而VEGF-A、VEGF-D、VEGFR-2的含量在两组中无差异。研究进一步发现，被癌细胞侵入的肥大细胞能高表达VEGF-C，而这种细胞在同一分化级别的高表达ES的J4小鼠中分布很少。肥大细胞主要参与肿瘤细胞的粘附和迁移过程，ES能特异性的抑制肥大细胞的这一过程，使VEGF-C的表达下调，进而抑制新生淋巴管生成，减少淋巴结转移［13］。Shunsuke等［14］发现含有ES基因的腺病毒(Ad-end)转染裸鼠后，Ad-end体外能抑制脐静脉内皮细胞增殖和微管形成，体内能抑制口腔原位移植瘤生长，与对照组相比，第23天，肿瘤体积被抑制2/3，淋巴管密度分别是(1.6 ± 1.1)个和(5.4 ± 1.3)个，淋巴结转移数量分别是(0，5/5)和(100%，5/5)，同时肿大淋巴结数量明显减少.免疫组化及蛋白印迹发现VEGF-C表达明显降低。Dong等［15］在实验中发现，Lewis肺癌小鼠随机分成2组分别给予恩度和生理盐水处理 ，治疗组肿瘤体积和转移瘤数量明显减小，淋巴管密度明显降低。发生转移的淋巴结数量明显减少，VEGF-C的表达明显下调(P＜0.001)。贾漪涛等［16］对宫颈癌移植瘤裸鼠进行实验发现，恩度可以通过抑制裸鼠宫颈癌模型的血管和淋巴管生成，而抑制肿瘤的生长和淋巴结转移。大剂量恩度(20 mk/kg)+顺铂组、小剂量恩度(10 mg/kg)+顺铂组和恩度组(10 mk/kg)的肿瘤生长速度明显慢于对照组和顺铂组(P＜0.05)。

四、ES抑制淋巴结转移和肿瘤新生淋巴管生成的其他机制

近年又陆续发现ES通过其他分子机制抑制淋巴管形成和淋巴结转移。ES的主要靶细胞是内皮细胞，ES是否会直接损伤内皮细胞进而抑制新生淋巴管形成?Yan等发现LECs表面有一种特异性受体——核仁素(nucleolin)，该受体选择性表达在新生淋巴管LECs上，而在成熟淋巴管LECs表面无表达，ES能直接抑制LECs迁移、微管形成以及ERK信号通路的激活等，对正常淋巴管无影响，而中和细胞表面的核仁素或者将核仁素基因敲除后，ES的上述作用消失。在动物实验中发现，PBS处理组的B16/F10黑色素瘤小鼠，广泛出现腋下和腹股沟淋巴结转移，ES处理组则淋巴结转移数明显降低，而ES联合抗核仁素抗体组则同样出现腋下和腹股沟淋巴结转移，即ES的存在不能翻转抗核仁素抗体的抑制效应，两组淋巴管podoplanin染色和LYVE-1都出现阳性，同时核仁素在两组新生淋巴管上都有高表达，而在正常小鼠LYVE-1阳性的皮肤、结直肠和淋巴结等处都未见有核仁素表达。乳腺癌小鼠模型中，腋下和腹股沟淋巴结转移现象在抗核仁素抗体组和ES联合抗核仁素抗体组之间无明显差别;而在乳腺癌肝脏转移实验模型中，抗核仁素抗体能抵消ES抑制肝脏微转移灶形成的效应。上述实验模型提示ES可能是在LECs表面的核仁素受体介导下抑制新生淋巴管形成，并抑制淋巴结转移［16］。

纤维连接蛋白选择性胞外区域A(extra domain A，EDA)是结肠癌细胞分泌的促淋巴管形成因子。整合素a9(integrin a9)也是淋巴管形成调节因子之一，可与VEGF-C/D结合，激活VEGF信号传导通路。Hou等在结肠癌SW480小鼠模型中发现，EDA是integrin a9的配体，二者形成复合物，共同定位於LECs表面，促进结肠癌新生淋巴管的形成。ES显著抑制EDA-integrin a9复合物在LECs上表达，ES 20ng/ml处理后该复合物表达出现明显的下降趋势，ES 40ng/ml时该复合物的表达即消失。近一步研究发现，ES能导致LECs细胞骨架结构破坏、极性改变和重排，抑制淋巴微管结构形成［17］。

五、ES抑制淋巴结转移和淋巴管生成的临床应用

恶性胸腔积液产生的原因，归纳起来可以包括两点:①肿瘤新生血管的生成，增加了毛细血管网的渗透面积，两者共同作用引起血管渗透性增加;②肿瘤细胞阻塞了淋巴管，增加了淋巴液流体静压，使淋巴回流受阻，因而水和蛋白质吸收减少，潴留于浆膜腔内［18］。Jiang等［19］在实验发现，重组人血管内皮抑素(恩度)经腹腔内注射治疗小鼠腹腔积液，能明显地降低小鼠腹膜的渗透性，显著减少实验小鼠腹水中VEGF水平，其中以恩度8 mg/kg和16 mg/kg剂量腔内注射治疗腹水效果最佳。Fang等［20］在Ad-end转染实验小鼠胸腔积液模型中发现，ES能抑制胸膜新生血管形成、降低胸膜血管通透性，抑制胸腔积液和胸膜转移性结节形成等作用。ES能治疗浆膜腔积液，除考虑与降低血管通透性，抑制积液形成有关外，可能与抑制淋巴结转移，通畅淋巴引流，促进积液排泄等过程中有重要关系。即一方面降低新生血管通透性，减少积液形成，另一方面减少肿瘤细胞发生淋巴结转移，减少淋巴管阻塞，通畅引流，在来源和去路两个方向产生作用。当然，上述实验未对胸膜或者腹膜进行淋巴管染色和HE染色，，淋巴管的管腔结构是否发生相应变化，淋巴结转移率是否下降等有待于后续实验进一步证实。

上述研究提示ES主要通过下调VEGF-C的表达，抑制淋巴管生成和淋巴结转移。这一通路被认为是经典途径。目前ES抑制肿瘤新生淋巴管生成和淋巴结转移的研究主要集中在鳞状细胞癌和肺癌等肿瘤模型中，原因可能是在这类肿瘤中，肿瘤细胞经淋巴结转移比血行播散更重要，而传统的手术、放化疗等方法尚不能达到完全抑制肿瘤转移的目的。除了下调细胞因子外，ES还直接作用于LECs表面的相关受体，抑制新生淋巴管形成和淋巴结转移。淋巴管形成和淋巴结转移之间有相辅相成的作用，促进肿瘤细胞转移。ES能抑制淋巴管生成和淋巴结转移，无疑对“抗血管生成治疗肿瘤”这一传统方案是锦上添花，未来我们努力的方向，应该是加强ES抑制肿瘤形成和转移机制的更深入了解，构建合理的基因治疗载体，以及联合放、化疗等多种治疗方案上，更好的提高肿瘤患者的生活质量。

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