结核分枝杆菌基因组单核苷酸多态性研究进展

刘海灿 万康林

目前,随着结核分枝杆菌 (M ycobacterium tuberculosis,M.tubercu losis)H 37Rv、CDC1551、H 37Ra、F11和KZN 1435等菌株全基因组测序工作的完成,以及新一代核酸测序技术的飞速发展,使得结核分枝杆菌研究进入新阶段,即可以从基因组水平对其进行更深入的研究[1～3]。近年来,有许多从基因水平研究结核分枝杆的菌种鉴定、菌株分型、分子进化以及药物敏感性检测等的文献报道[4～10]。本文将就结核分枝杆菌基因组单核苷酸多态性 (single nuc leotide po lymorphism s,SNP)的鉴定、检测方法及其应用研究进行综述。

SNP主要是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的基因组DNA序列多态性,这种多态性包括单个碱基的转换 (transition)、颠换 (transversion)、插入(insertion)和缺失 (deletion)等 4种形式,但研究中通常认为 SNP仅包括转换和颠换两种形式。SNP可位于基因组的基因编码区、非基因编码区和基因间隔区,如果 SNP发生在基因编码区,但未造成基因编码的氨基酸序列改变,称为同义 (synonymous)SNP,若造成基因编码的氨基酸序列改变或肽链被提前终止,则称为非同义(non-synonymous)SNP。

一、结核分枝杆菌基因组 SNP的鉴定方法

结核分枝杆菌基因组 SNP有多种鉴定方法,但依据其基本原理可分为两大类:一类是DNA测序相关方法,主要有全基因组测序和目的基因片段测序两种;另一类是基于 PCR扩增的非DNA测序方法,如实时定量 PCR(real-tim e PCR,RT-PCR)、PCR限制性片段长度多态 (PCR-RLFP)、PCR单链构象多态(PCR-SSCP)、基因芯片(基因探针)检测等。

1.基于DNA测序分析的 SNP鉴定方法:(1)全基因基组测序分析:随着核酸测序技术的飞速发展,全基因组测序所需时间和经济成本不断降低,完成全基因组测序的微生物菌株越来越多,使得我们能够从全基因组水平研究和分析不同菌株间的差异以及其生物学意义。例如:Fleischm ann等[1]完成了结核分枝杆菌 CDC1551株的全基因组测序工作,并结合已经发布的 H 37Rv株序列数据进行了比对分析。通过分析发现了多个基因的 SNP,另外发现包括 PE/PPE基因家族 (PE/PPE gene fam ily)在内的一些基因家族,在全基因组水平有较高水平的同义和非同义 SNP的发生。(2)目的基因 DNA片段测序分析:虽然全基因组序列比对分析可以更全面地发现不同菌株间的 SNP,但是受到完成全基因组测序的菌株数量和费用等条件限制,于是人们研究建立了更经济、高效的目的基因DNA片段测序分析方法,并广泛应用于结核分枝杆菌基因组 SNP鉴定研究。例如:Baker等[11]用 PCR扩增了结核分枝杆菌 7个管家基因片段 (rpo B、ka t G、oxy R,ahp C,pnc A,rps L,和 gyr A),经纯化、回收后用AB Ip rism 3700测序仪进行测序,研究这些基因 DNA序列中的 SNP。Talarico等[12]用PCR对 200株临床菌株的 PE_PGRS16和 PE_ PGRS26基因进行扩增并测序,再与 H37Rv序列进行比对分析,发现了两个基因序列中的 SNP以及其他DNA序列多态性。

2.其他非DNA测序的 SNP鉴定方法:非测序相关的鉴定方法,主要是与 PCR相结合进行特异性位点的 SNP检测,通常已确认某位置存在 SNP,用来检测该 SNP在检测样本或者群体中的分布情况。常用的方法主要有:(1)RT-PCR:RT-PCR方法是常用的 SNP验证方法,特点是快速、简便,但不同研究中建立的 RT-PCR方法稍有差异。例如:Ereqat等[13]用 RT-PCR结合高分辨率熔解试验的方法,检测nar GHJI和 oxy R基因中的 SNP及第 1个差异区 (region of difference 1,RD 1),快速鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌 (M ycobacterium bovis,M.bovis)。而 Hazbon等[14]采用了发夹状引物 (hairp in p rim ers)来进行RT-PCR实验,通过比较引物与模板互补的反应和引物与模板不互补的反应的 RT-PCR循环阈值的差异 (ΔCt),分析不同菌株中的 SNP存在情况。(2)PCR-RFLP:如果 SNP发生在限制性内切酶识别位点上会导致酶切位点的增加或消失,利用这一酶切性质的改变,将特异的 PCR扩增产物经限制性内切酶切割后,用琼脂糖凝胶电泳分离,再与正常 PCR产物酶切图谱进行比对分析即可确认 SNP的存在情况。例如:Gibson等[15]用 PCR-RFLP方法检测Ag85C(Rv0129c)基因第 103位密码子的 1个 SNP (GAG-GAA),PCR目的片段的大小为 519bp,用M n lI限制性内切酶切割,再用 4%琼脂糖凝胶进行分离。如果该 SNP存在,仅会有 461bp和 58bp两个条带;若不存在则会是 365、96和 58bp 3个条带 (电泳图上看不到 58bp条带),从而确定该基因中的 SNP存在情况。(3)PCR-SSCP:SSCP测定中双链 DNA被变性成为单链DNA,每条单链DNA都基于其内部序列不同而呈现出独有的折叠构象,这些单链DNA在非变性条件下用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,由于折叠构象和电泳时温度的不同而呈现出不同的迁移率和带型,最后依据电泳图谱类型确认样品中的 SNP情况。例如:Torres等[16]用 PCR-SSCP方法检测了两个利福平和 1个异烟肼耐药相关基因(rpo B、ka t G和 ahp C)的 DNA序列变异情况,确认了检测样品中 3个基因的 SNP发生情况。(4)基因芯片和基因探针法:由于基因芯片可进行高通量 (high -throughput)的实验操作和分析,近年来也被用于结核分枝杆菌基因组 SNP的验证和分析。例如:Deng和 Xu等[17,18]在研究中采用了不同的芯片检测方法,研究利福平耐药相关基因 rpo B中的 SNP情况。他们发现芯片法和DNA测序确定的 rpo B基因中的 SNP情况具有较高的一致性,可用来检测大量样品 rpo B基因的 SNP情况。(5)其他 PCR方法:除了上述方法外,还有一些特异性的以 PCR为基础的 SNP鉴定方法。例如:A lix等[19]在鉴定 Haarlem基因型特异的SNP标志时,建立了一种“On/O ff sw ich assay”方法,针对测序分析发现的 m g t C基因 SNP,设计了特异性的 PCR扩增引物,依据不同引物能否扩增出目的基因片段,验证基因序列中的 SNP情况。M arm e等[20]应用荧光光谱分析方法,可快速检测 PCR产物中目的片段的 SNP情况。

二、结核分枝杆菌基因组 SNP的应用

上述各种鉴定方法确认的结核分枝杆菌基因组SNP,被广泛应用于菌种鉴定、菌株分型、药物敏感性检测,以及进化分析和流行病学监测等多个方面。

1.药物敏感性检测:目前的研究认为,结核分枝杆菌耐药性的发生由多个基因突变导致,耐药性相关基因的 SNP检测成为结核分枝杆菌药物敏感性检测的重要方法[16,21～24]。如:异烟肼耐药相关 SNP主要发生在:ka t G、ahp C、inh A、kas A和 ndh等基因中, ka t G315密码子 SNP在异烟肼耐药株有 30%～60%发生率,而 rpo B526和 rpo B531密码子的 SNP与结核分枝杆菌高水平的利福平耐药相关[25]。近年来,随着结核分枝杆菌二线药的应用和耐药菌株的出现,二线药耐药相关基因的 SNP研究也多有报道[26]。这些耐药性相关 SNP的发现和其检测方法的建立,为结核分枝杆菌药物敏感性的快速鉴定奠定了基础,也将为临床上针对耐药性结核的药物治疗提供支持。

2.菌种快速鉴定:结核分枝杆菌和牛分枝杆菌等均可引起人类感染并导致结核病症状,而不同菌种感染临床上有不同的治疗措施,因此,患者感染菌株的快速菌种鉴定也是临床上采取针对性治疗的迫切需要。Chauhan等[5]研究发现牛分枝杆菌和卡介苗(bacillusCalm ette-Guérin,BCG)nar K2X基因启动子区域有 1个 SNP突变,这个 SNP的存在造成两者与结核分枝杆菌在缺氧环境中诱导表达硝酸/亚硝酸还原酶能力的差异。通过检测这个 SNP可快速、准确的把结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合群 (M.tubercu losis comp lex,M TC)其他成员,包括牛分枝杆菌、卡介苗、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.m icroti)区分开。

3.分子分型:(1)结核分枝杆菌北京家族(Beijing fam ily)特异的 SNP标志:结核分枝杆菌北京家族(M. tubercu losis Beijing fam ily)或称结核分枝杆菌北京基因型 (M.tubercu losis Beijing geno type)被认为具有更高的毒力和传播能力,有明确的机制证明其与某些药物耐药相关,并被报道与多起结核病暴发相关,是一个被密切监测的谱系 (lineages),因此,需要建立北京家族快速、准确的鉴定方法。Homo lka等[7]研究认为Rv2629等位基因中的 A 191C突变是北京基因型的生物学标志,A lonso等利用该 SNP标志建立了一种与 RT-PCR结合的高分辨率熔解 (high-resolution m elting)实验,可快速区分北京家族与非北京家族的菌株。(2)结核分枝杆菌其他基因型相关的 SNP标志:除了北京型特异的 SNP标志,也有文献报道其他基因型相关的特异几天 SNP标志。例如,Chuang等[6]的研究发现,在结核分枝杆菌 fad D28基因 507位密码子存在ATC到ATT的突变,该 SNP的存在可作为结核分枝杆菌东亚群 (east asia lineage)的特异性标志。A lix等[19]通过对具有代表性的临床菌株的研究发现,m g t C基因中的一个 SNP(A 182C)与 Haarlem基因型相关。

4.进化分析和流行病学研究:(1)进化分析:许多研究认为结核分枝杆菌基因组 SNP可被用来进行进化分析,特别是其中的同义 SNP,由于研究认为其不受选择压力的影响,被认为是进行结核分枝杆菌进化分析的理想生物学标。例如:Sreevatsan等[27]通过DNA测序和与 PCR相结合的酶切分析,依据 ka t G463和 gyt A95两个非同义 SNP突变,成功将属于M TC的菌株划分为 3个基因群 (Group 1/2/3),其中第 1群进化上相对古老,可能与牛分枝杆菌来自同一进化祖先。Fillio l等[28]用 212个 SNP标记对来源于全球的323株样品进了检测,并依据 SNP标志的发生情况进行聚类分析,将结核分枝杆菌分为 6个主要的 SNP聚集群(SNP c luster groups,SCGs)和 5个亚群 (subgroup)。两者研究结果具有很好的一致性,所有的Group 1菌株都分布在 SCG-1、SCG-3a和 SCG-2 3个群中,所有的 Group 2菌株都分布在 SCG-3b/c、SCG-4和 SCG-5群中,所有的 Group 3菌株都为SCG-6a/b群的菌株。(2)流行病学研究:结核分枝杆菌基因组 SNP,也可用来对从同一个感染链条、不同患者体内分离的菌株进行进化分析,进而对整个感染链条进行清楚的流行病学分析。如 Schurch等[29]对处于一个确认的结核分枝杆菌传播和感染链条中的患者体内分离的菌株,通过DNA测序分析及其他鉴定方法,确认了包括4个 SNP在内的6个多态性位点。Schurch等研究认为这种患者间的菌株进化速度和进化模式分析表明,结核分枝杆菌在体内的分子进化是由短时的变异暴发 (burstsofm utation)和相对较高的基因组稳定性共同决定的,这种进化与变异机制,为抗结核疫苗和药物的开发、应用,以及结核分枝杆菌感染暴发的管理提供了重要依据。

三、结核分枝杆菌基因 SNP研究展望

目前,临床上相当数量的结核分枝杆菌感染者,由于受结核分枝杆菌分离培养的时间、技术和实验室硬件等要求的限制,其感染的菌株并没有得到及时的分型鉴定和药物敏感性检测,仅能给予经验性的治疗措施,不利于结核病 (特别是耐药性结核)的治疗和控制。但综上可知,上述 SNP检测方法的建立和广泛应用,为快速、高效地进行临床标本的菌型鉴定和耐药性检测创造了条件,也给临床上实施针对性的治疗方案提供支持。同时,由于其在进化分析方面的广泛应用,也为结核分枝杆菌的进化研究和流行病学监测提供了有力支持,通过对结核分枝杆菌基因进化的研究和分析,可以更深入了解不同菌株间毒力差异的机制,为疫苗和抗结核药物的开发提供理论依据;而作为流行病学监测手段,可以为我们提供明确的传播和感染模型,为结核分枝杆菌感染的预防、控制策略的制订和实施提供理论和技术支持。

结核分枝杆菌基因组 SNP研究的不断深入和应用的日益广泛,为我们更深入地进行结核分枝杆菌相关研究提供了新的研究方法和研究方向,也为临床结核分枝杆菌感染的快速诊断和治疗提供了便利,将会促进我们对结核分枝杆菌进化、致病机制、流行与传播特征以及感染后免疫和耐药发生机制的认识,并将为最终实现结核病预防和控制目标提供帮助。

1 Fleischmann R D,et a l.W hole-genome comparison ofM ycobacterium tuberculosis clinicaland laboratory strains.JBacterio l,2002,184 (19):5479-5490

2 GutackerM M,eta l.Genom e-w ide analysisof synonymous single nuc leo tide po lymo rphism s inM ycobacterium tubercu losis comp lex organism s:resolution of genetic relationshipsamong closely relatedm icrobial strains.Genetics,2002,162(4):1533-1543

3 Zheng H,eta l.Genetic basisof viru lence attenuation revealed by comparative genom ic analysisofM ycobacterium tubercu losis strain H 37Ra versusH 37Rv.PLoSOne,2008,3(6):e2375

4 W ang H,et a l.Rap idm ethod for identification of six common species ofm ycobacteria based onm u ltip lex SNP analysis.J Clin M icrobio l, 2010,48(1):247-250

5 Chauhan S,A Singh and JS Tyagi.A single-nucleotidemutation in the-10 p romoter region inactivates the narK2X p romoter inM ycobacterium bovis andM ycobacterium bovisBCG and has an app lication in diagnosis.FEMSM icrobiolLett,2010,303(2):190-196

6 Chuang P C,H Y Chen,and R Jou.Single-nuc leotide po lymorphism in the fadD28 gene as a geneticmarker for EastA sia L ineage M ycobacterium tuberculosis.JC linM icrobiol,2010,48(11):4245-4247

7 Homolka S,et a l.Single-nucleotide polymorphism s in Rv2629 are specific forM ycobacterium tuberculosis genotypes Beijing and Ghana butnotassociatedw ith rifamp in resistance.JClinM icrobiol,2009,47 (1):223-226

8 RindiL,et a l.Evolutionary pathway of the Beijing lineage ofM ycobacterium tubercu losis based on genom ic deletions and mutT genes po lymorphism s.Infec tGenet Evo l,2009,9(1):48-53

9 DosVu ltos T,eta l.Evolution and d iversity of clonalbac teria:the paradigm ofM ycobacterium tubercu losis.PLoSOne,2008,3(2):e1538

10 Chakravorty S,et a l.Rifamp in resistance,Beijing-W clade-single nucleotide po lymorphism cluster group 2 phylogeny,and the Rv2629 191-C allele in M ycobacterium tubercu losis strains.JC lin M icrobio l,2008,46(8):2555-2560

11 Baker L,et a l.Silent nuc leotide po lymo rphism s and a phy logeny for M ycobacterium tubercu losis.Em erg InfectD is,2004,10(9):1568-1577

12 Talarico S,et a l.M ycobac terium tubercu losis PE_PGRS16 and PE_ PGRS26 genetic polymo rphism among clinical iso lates.Tubercu losis (Edinb),2008,88(4):283-294

13 Ereqat S,et a l.Rap id differentiation ofM ycobacterium tubercu losis and M.bovisby high-reso lutionm elt curve analysis.JC linM icrobio l,2010,48(11):4269-4272

14 HazbonM H and D A lland.Hairp in p rim ers for simp lified single-nucleotide po lymo rphism analysisofM ycobacterium tubercu losis and othero rganism s.JC lin M icrobio l,2004,42(3):1236-1242

15 Gibson,A L,et a l.App lication of sensitive and specificmolecular m ethods to uncover global dissem ination of themajor RDRio Sublineage of the Latin American-M editerraneanM ycobacterium tuberculosis spoligotype fam ily.JC linM icrobiol,2008,46(4):1259-1267

16 TorresM J,et a l.Rifamp in and isoniazid resistance associatedmutations inM ycobacterium tubercu losis clinical isolates in Seville,Spain. Int JTuberc Lung D is,2002,6(2):160-163

17 Deng J Y,et a l.O ligonuc leotide ligation assay-based DNA chip for m ultip lex detection of single nuc leotide polymorphism.B iosensB ioelectron,2004,19(10):1277-1283

18 Xu C,eta l.On-chip ligation ofmultip lexing p robe-pairs for identifying pointmutations out of dense SNP loci.B iosens B ioelectron, 2008.24(4):818-824

19 A lix E,SGodreuiland A B B lanc-Potard.Identification of a Haarlem genotype-specific single nucleotide polymorphism in themgtC virulence gene of M ycobacterium tuberculosis. J C lin M icrobiol, 2006,44(6):2093-2098

20 M arm eN,eta l.Identification of single-pointm u tations inm ycobacterial16S rRNA sequences by confocal single-mo lecu le fluorescence spectroscopy.Nucleic A cidsRes,2006,34(13):e90

21 W u X,eta l.M o lecu larm echanism sof d rug resistance inM ycobacterium tubercu losis c linical iso lates.Chin M ed J(Engl),1999,112 (6):524-528

22 Rom ero B,et a l.D rug suscep tibility of Spanish M ycobacterium tubercu losis comp lex iso lates from anim als.Tubercu losis(Edinb),2007, 87(6):565-571

23 Cardoso R F,et a l.Sc reening and characterization ofm u tations in isoniazid-resistantM ycobacterium tubercu losis isolatesobtained in B razil.Antim icrob AgentsChemother,2004,48(9):3373-3381

24 Tracevska T,et a l.M utations in the rpoB and katG genes leading to d rug resistance inM ycobacterium tuberculosis in Latvia.JClinM icrobiol,2002,40(10):3789-3792

25 Johnson R,et a l.D rug resistance inM ycobacterium tubercu losis.Curr IssuesMo lB iol,2006,8(2):97-111

26 Ram irezM V,et a l.Rap id detection ofmultidrug-resistantM ycobacterium tubercu losis by use of real-time PCR and high-reso lution meltanalysis.JC linM icrobio l,2010,48(11):4003-4009

27 Sreevatsan S,eta l.Restricted structuralgene polymorphism in theM ycobacterium tuberculosis comp lex indicatesevo lutionarily recentglobal dissem ination.Proc Natl Acad SciU SA,1997,94(18):9869-9874

28 Fillio l I,et a l.Globalphylogeny ofM ycobacterium tuberculosis based on single nuc leotide polymorphism(SNP)analysis:insights into tuberculosis evo lution,phylogenetic accuracy of otherDNA fingerp rinting system s,and recommendations for am inimal standard SNP set.J Bacteriol,2006,188(2):759-772

29 Schurch A C,eta l.The tempo andmode ofmolecularevo lution ofM ycobacterium tuberculosis at patient-to-patient scale.Infect Genet Evol,2010,10(1):108-114