利用稻草液体发酵产纤维素酶及酶粉提取的研究＊

谭 宏，刘选明，盛培科，廖胜辉，黄小峰，何 迪

（湖南大学 生物学院，湖南 长沙 410082）

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称[1－2].纤维素在地球上的有机质中分布最广，含量最丰富.湖南省的纤维素资源十分丰富，每年仅稻草就多达数千万吨.因此，纤维素的开发利用与转化对于解决工农业原料来源、世界能源危机、环境污染等问题具有重要意义.纤维素酶已广泛应用于饲料、医药、食品加工、生物能源、油井开采、细胞生物工程和工业洗涤剂等行业.

纤维素酶的工业化生产目前主要有固体发酵法和液体深层发酵法2种[3－4].固体法工艺简单，易污染，难控制.液体深层发酵技术水平先进，难度大，仅有美国、日本等几个国家掌握并用于生产，特点是发酵原料利用率高，生产条件易控制，是当今世界纤维素酶生产的主攻方向.纤维素酶的提取方法有盐析法、有机溶剂沉淀法等[5].盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，随盐浓度增高到一定数值时，蛋白质表面电荷被中和，引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出[6].有机溶剂沉淀法是用与水可混溶的有机溶剂，如乙醇等，使蛋白质溶解度降低并析出，但此法易使蛋白质变性，应在低温下进行[7].本研究综合各方面因素拟用盐析法提取纤维素酶.生产纤维素酶的菌种有很多，如细菌、真菌等，唯以真菌所产纤维素酶组份最齐全，且是胞外酶，故是工业生产的首选菌种[8].本课题选用的 HC－415菌株，属真菌中的里氏木霉，可利用稻草分泌高活性的纤维素酶；同时，还可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶和蛋白酶等.

1 材料、仪器与试剂

菌种：里 氏 木 霉 （Trichodermareesei）HC－415，湖南大学生物学院提供.材料与试剂：稻草粉，豆粕，麸皮，羧甲基纤维素钠，新华1号滤纸等.仪器设备：30L规模发酵罐，旋转式摇床，高速冷冻离心机等.

2 培养基

斜面种培养基：PDA培养基.一级种培养基（%，w／v）：麸皮2，葡萄糖3，（NH4）2SO40.15，pH 5.5～6.0.二级产酶培养基（%，w／v）：稻草粉5，豆粕粉1，KH2PO41.0，CaCl20.6，聚 醚0.6，pH 5.5～6.0.一级种接种量为15%（v／v）.

3 实验方法

3.1 纤维素酶液体深层发酵法

将HC－415菌斜面种的孢子液接入一级种培养基，28～30℃旋转式摇床上培养40h，再接入30L规模罐二级产酶培养基中进行液体深层产酶发酵试验.

3.2 酶活性测定方法

羧甲基纤维素（CMC）酶活性测定：DNS法.

滤纸糖酶（FPA）活性测定：参照 Mandels[9]、蒋传葵[10]DNS法.1mL适当稀释的酶液中加入1 mL 0.05mol／L （pH4.6）缓冲液和1条1cm×6 cm新华1号滤纸.50℃酶解60min，加3mL DNS试剂.沸水浴10min，测还原糖，扣除空白后计算酶活性.

酶液酶活性单位规定为：1h水解生成1mg葡萄糖的酶量为1个活性单位（U）.酶粉酶活性使用国际单位（IU）：1min水解生成1μmol葡萄糖的酶量为1个国际单位（IU）.

3.3 纤维素酶的提取

酶粗提取液的制备：放罐收集的发酵液，离心除去稻草等固型物，上清液即为酶粗提取液，粗酶液应立即进行后续处理，否则，应放入4℃冰箱保存.

硫酸铵盐析：在酶粗提取液中缓慢加入20%饱和度硫酸铵[11]，静置2h，4℃离心20min，除去杂蛋白，取上清液缓慢加入80%饱和度硫酸铵，溶解后6 500r／min 4℃离心20min，沉淀用pH 5.0醋酸盐缓冲液溶解，得纤维素酶浓缩液，于4℃冰箱保存.

浓缩液透析：向透析袋中加入浓缩液，预留约1／3的空间.在50%甘油的pH4.6的0.1mol／L醋酸－醋酸钠缓冲液中透析4h.

纤维素酶粉的制取：将纤维素酶浓缩液放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为－50℃，真空度14～16Pa，冷冻24h制得纤维素酶粉.

4 结果与讨论

4.1 30L规模罐中HC－415菌产纤维素酶发酵过程动态变化

30L规模发酵罐装液量20L，搅拌速度为200～450r／min，通气量0.25～0.6L／（min·L），发酵温度30±1℃，罐压0.01～0.03MPa，培养144h.消泡剂聚醚添加量为0.6%.发酵过程中，间隔2h测定并记录pH、通气量、温度、搅拌速度、泡沫等的变化；每隔12h取样检测酶活性，结果表明，如图1，24h前CMC酶和FPA酶活性很低，基本处于停滞期.之后酶活性快速增长，CMC酶和FPA酶活性在120h达到高峰，120～132h酶活性处于高峰稳定期，综合各因素，最适发酵周期为132h.

4.2 纤维素酶提取时酶的活性及酶活性得率

30L规模罐发酵液纤维素酶提取及酶活性得率结果见表1.冻干酶粉CMC酶活性平均为355.0 IU／g，最高为388.3IU／g，FPA平均为44.3IU／g，最高为58.2IU／g.相对发酵液得率平均为16.00 g／L.酶粉对发酵液CMC酶活性平均得率为77.16%，最高为89.14%，FPA酶活性平均得率为58.10%，最高为82.95%.

图1 30L规模罐中HC－415菌产纤维素酶液体发酵动态曲线图Fig.1 The graph of cellulase liquid fermentation by HC－415fungus in 30Lfermenter

表1 30L规模罐发酵液纤维素酶活性及酶活性得率Tab.1 Cellulase activity and yield from 30Lfermenter broth

4.3 透析对纤维素酶活性得率的影响

将第3批次的纤维素酶浓缩液进行透析，如表2，透析后体积缩小了35.0%，CMC酶活性得率为96.0%，FPA酶活性得率为95.5%.表明通过透析起到了浓缩的作用，而酶活性损失很少.透析后的浓缩液制得的酶粉活性为：CMC酶634.9IU／g，FPA84.7IU／g，表明透析还起到了脱盐纯化作用.

4.4 HC－415菌所产纤维素酶的最适pH

配制pH为3.0～9.0的磷酸氢二钠和柠檬酸缓冲液，将HC－415菌所产纤维素酶液稀释到适当倍数，测定各pH 值的FPA酶活性（图2），表明HC－415菌所产纤维素酶的最适pH值在4.0～5.0之间.

表2 透析对纤维素酶活性的影响Tab.2 The effect of dialysis for cellulase activity

图2 不同pH下的HC－415菌FPA酶活性变化趋势Fig.2 FPA variation tendency in different pH buffer solution

4.5 HC－415菌所产纤维素酶的最适反应温度

将HC－415菌所产纤维素酶液稀释到适当倍数，在30～70℃的水浴锅中测定该菌FPA活性（图3），表明其最适反应温度在50～60℃之间.

图3 不同反应温度下的HC－415菌FPA酶活性变化趋势Fig.3 FPA variation tendency in different reaction temperature buffer solution

4.6 HC－415菌纤维素酶粉性质比较

几种纤维素酶粉有关特性及酶活性测定结果见表3.溶解性方面，HC－415与 ONOZUKA R－10酶粉均易容于稀醋酸盐缓冲液，溶液淡黄透明.上海酒精二厂的纤维素酶粉仅溶解一部分，呈棕色混浊状.HC－415与 ONOZUKA R－10酶粉均呈砂色.HC－415菌纤维素酶粉比上海酶粉FPA酶活性高29.9 IU／g.所以，在溶解性、色泽及FPA活性等方面，HC－415菌所产纤维素酶粉已接近或达到国内、国外商品酶酶粉指标.

表3 不同纤维素酶粉性质及活性比较Tab.3 Qualities and activity for several different cellulase powders

[1] WOOD T M.Cellulase of trichoderma koningii[J].Methods in Enzymology，1988，160（24）：221－223.

[2] WOOD W A，KELLOGG S T.Cellulose and hemicellulose[M].USA：Academic Press Inc，1988.

[3] 谭宏，谢小保，莫勇，等.里氏木霉液体发酵产纤维素酶的研究[J].工业微生物，1996，26（1）：7－11.TAN Hong，XIE Xiao－bao，MO Yong，etal.Production of cellulase using submerged fermentation byTrichodermareeseiHC－415[J].Industrial Microbiology，1996，26（1）：7－11.（In Chinese）

[4] 张树政.酶学研究技术（上册）[M].北京：科学出版社，1987.ZHANG Shu－zheng.Enzymology research technology（rudin）[M].Beijing：Science Press，1987.（In Chinese）

[5] 曹军卫.微生物工程[M].北京：科学出版社，2002.CAO Jun－wei.Microbiology engineering[M].Beijing：Science Press，2002.（In Chinese）

[6] 高培基，曲音波，王祖农.绿色木霉的内切葡聚糖酶在纤维素水解中作用机制的研究 [J].自然科学进展，1992，21（3）：253－259.GAO Pei－ji，QU Yin－bo，WANG Zu－nong.The study on cellulose hydrolysis mechanism forTrichodermareeseiendoglucanase[J].Progress in Natural Science，1992，21（3）：253－259.（In Chinese）

[7] 崔福绵，刘菡，韩辉.康宁木霉CP88329纤维素酶产生条件的研究[J].微生物学通报，1995，22（2）：72－76.CUI Fu－mian，LIU Han，HAN Hui.Studies on the conditions for cellulase production fromTrichodermakoningiiCP88329[J].Microbiology，1995，22（2）：72－76.（In Chinese）

[8] 叶姜瑜.一种纤维素分解菌鉴别培养基[J].微生物学通报，1997，24（4）：251－252.YE Jiang－yu.A new differential medium for cellulose decomposing microorganisms[J].Microbiology，1997，24（4）：251－252.（In Chinese）

[9] MANDELS M.Cellulose as a chemical and energy resource[J].Biotechnol Bioeng，1975（5）：81－85.

[10] 蒋传葵.工具酶的活力测定[M].上海：上海科学技术出版社，1982：79－81.JIANG Chuan－kui.The activity determinations on tool enzymes[M].Shanghai：Shanghai Scientific and Technical Publishers，1982：79－81.（In Chinese）

[11] 谭宏，刘淑欢，李剑英，等.长梗木霉纤维素酶的产生及提取[J].微生物学通报，1993，20（2）：90－93.TAN Hong，LIU Shu－huan，LI Jian－ying，etal.Studies on the cellulase production and extraction fromTrichoderma Longibrachiatum[J].Microbiology，1993，20（2）：90－93.（In Chinese）