新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

赵金花，沈志强，朱 辉，李 峰1,，甄洪花，苗立中1,，单 虎

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109；3.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600)

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由DVH病毒(Duck hepatitis virus，DHV)引起雏鸭的一种以肝脏病变为主要病理变化的急性致死性传染病。近年来，国内外相继报道了新型DHV(N-DHV)。2002年，苏敬良等从北京和广西分离到2株与DHV-1及DHV-3型无血清学相关性的DHV，并将其定为N-DHV[1]。范书才等对从广东分离的DHV GD株进行生物学和理化学特性以及交叉中和试验，鉴定结果表明GD株的抗原性与DHV-1无关，属于N-DHV[2]。2007年，Tseng等在台湾发现一株新型DHV[3-4]，同年Kim等在韩国也发现了一株N-DHV，并对其进行基因组序列测定与分析[5-6]。N-DHV的不断出现严重危害养鸭业的发展。

本研究对从广西、河南和山东发病鸭体内分离的3株病毒进行初步鉴定，确定为N-DHV。并对分离株的VP1基因进行序列测定及相关分析，为N-DHV分子流行特点的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料 病料样品分别来自广西、河南以及山东发病鸭场；DHV-1及DHV-1阳性血清购自中国兽医药品监察所；N-DHV阳性血清由山东省滨州畜牧兽医研究院实验室制备，中和效价≥1∶64；SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司；鸭胚及雏鸭均购自滨州久久鸭场。

1.2 主要试剂 反转录酶(M-MuLV)购自北京百泰克生物技术有限公司；反转录酶抑制剂、dNTP、rTaqDNA聚合酶、DNA Marker购自TaKaRa公司；TRIzol购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 样品处理 将病料样品按1∶5比例加入灭菌生理盐水，匀浆捣碎，反复冻融3次，8000 r/min离心10 min，取上清液加入青霉素、链霉素使其终浓度均为2000 IU/mL，37℃作用30 min，以0.22 μm过滤备用。

1.4 RT-PCR检测 参照文献[7]由上海生工生物工程技术服务有限公司合成鉴定N-DHV的引物。参照TRIzol说明书提取病毒RNA。反转录条件为：70℃ 5 min；42℃ 1 h；70℃ 10 min。PCR反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃1 min，30个循环；72℃10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 病毒分离 将处理的病料样品经尿囊腔途径接种11日龄鸭胚，接种量为0.2 mL/胚；同时设等量灭菌生理盐水对照组。分别孵化，观察鸭胚的病变和死亡情况，并收获24 h～96 h尿囊液继续传代。

1.6 病毒鸭胚半数致死量(ELD50)测定 以生理盐水将鸭胚分离病毒株作10倍系列稀释，取适宜稀释度鸭胚毒接种11日龄鸭胚，每个稀释度接种5枚，0.2 mL/胚，37℃继续培养，观察并记录鸭胚的死亡数目。按Reed-Muench法计算病毒ELD50。

1.7 血清中和试验 采用固定病毒稀释血清法。将DHV-1和N-DHV阳性血清(中和效价≥1∶64)分别于56℃灭活30 min，进行10倍倍比稀释，各取0.5 mL分别与等量200 ELD50分离株混匀，37℃作用1 h，经尿囊腔分别接种11日龄鸭胚，每组接种5枚，0.2 mL/胚，同时设病毒和生理盐水对照组。37℃培养，观察6 d，记录各组的死胚数目。

1.8 动物回归试验 将病毒液稀释为200 ELD50，颈部皮下注射无DHV母源抗体的3日龄雏鸭5只，0.3 mL/只。另设5只正常对照，隔离饲养观察7 d。

1.9 SPF鸡胚感染试验 取分离的3株病毒鸭胚尿囊液经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.2 mL/胚，盲传5代后收获尿囊液。

1.10 细胞接种试验 将分离的3株病毒鸭胚尿囊液分别接种单层鸡胚成纤维细胞，盲传5代后取细胞培养液接种11日龄鸭胚，检测病毒是否能够在其中增殖。

1.11 VP1基因的扩增

1.1 1.1 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的 N-DHV VP1基 因 序 列(AP-03337，DQ25613；AP-04009， DQ25613； AP-04114， DQ812093；AP-04203，DQ25613)，设计引物：F：5'-CGGATCC GGTGATTCCAATCAGCT-3'和 R：5'-CCCAAGCTTT TCAATTTCCAAATGGA-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，扩增片段长度为720 bp。

1.1 1.2 分离株VP1基因的扩增 提取分离株RNA，并进行RT-PCR扩增。PCR反应条件为：94℃5 min；94℃ 50 s、60℃ 50 s、72℃ 1 min，30个循环；72℃10 min。产物琼脂糖凝胶电泳检测，并克隆至pMD18-T载体中进行鉴定，鉴定正确的重组质粒测序。并与GenBank中登录的DHV参考株VP1基因进行序列比对，构建系统进化树。所用病毒株及其GenBank登录号为：DHV-A(03D，DQ249299； 5886， DQ249301； A66， DQ886445)DHV-B(90D，EF067924；04G，EF067923)和 DHV-C(AP-03337， DQ25613； AP-04009， DQ25613；AP-04114，DQ812093；AP-04203，DQ25613)。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果 采用N-DHV鉴别引物对分离株进行RT-PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后可见约为700 bp清晰条带，与预期片段大小(705 bp)一致(图 1)。

2.2 鸭胚病毒分离结果 将病料样品接种11日龄易感鸭胚，24 h～96 h死亡鸭胚肝脏出血，肿大，收获其尿囊液继续传代。分离获得3株病毒，从广西、河南、山东分离到的病毒分别依次命名为GX株、HN株、LZ株。

2.3 病毒鸭胚ELD50分离病毒GX株、HN株、LZ株的ELD50值分别为10-3.29/0.2 mL、10-4.25/0.2 mL和10-4.65/0.2 mL。

2.4 血清中和试验结果 分别以DHV-1和N-DHV阳性血清与分离株进行交叉中和试验，结果表明：DHV-1阳性血清对分离株无中和作用，接种的鸭胚在48 h～96 h全部死亡，表明分离株不是DHV-1；分离株对照组接种的鸭胚在48 h～96 h也全部死亡，而N-DHV阳性血清对分离株具有保护作用，鸭胚仅在96 h死亡1只，因此分离株可以判定为N-DHV(表 1)。

2.5 动物回归试验结果 攻毒组雏鸭在48 h开始发病死亡，在96 h内GX株、HN株、LZ株的死亡率分别为50%、70%和65%，表明分离的3株病毒的毒力存在一定差异。死亡鸭呈现典型的DVH症状和病理变化，角弓反张、肝脏肿大、有出血点、出血斑，而对照组鸭无任何症状。

表1 血清中和试验结果Table 1 The neutralization tests of the isolates with different anti-serum

2.6 分离株接种SPF鸡胚试验 经SPF鸡胚连续传5代，鸡胚发育正常，无死亡，再返传鸭胚也未出现死亡，表明分离株不能在鸡胚中增殖。

2.7 细胞接种试验结果 分离株接种鸡胚成纤维细胞，传至第3代时细胞出现病变，分离株传代至第5代，接毒60 h后，细胞皱缩、死亡、脱落，产生明显病变。将第5代细胞培养液接种鸭胚后，鸭胚也出现病变、死亡，表明分离株可以在鸡胚成纤维细胞中增殖(图2)。

2.8 分离株VP1基因的PCR扩增结果 VP1基因PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，扩增片段约720 bp，与预期目的片段大小一致(图3)。

2.9 VP1基因序列分析 测序结果表明分离株GX、LZ、HN的VP1基因均为714 bp。将3个分离株的VP1基因序列与GenBank中登录的序列进行同源性比较，结果显示：3个分离株核苷酸序列与DHV-A、DHV-B、DHV-C的序列同源性分别为68.1%～69.6%、70.7%～71.4%、92.4%～94.8%，氨基酸序列同源性分别为75.7%～76.6%、78.4%～79.4%、91.9%～92.8%(图 4)。3个分离株与DHV-C的同源性最高，与DHV-A的同源性最低。与DHV-A相比，分离株的VP1基因存在连续3个氨基酸的插入和1个氨基酸的缺失；而与DHV-B相比，分离株的VP1基因存在连续3个氨基酸的插入和连续2个氨基酸的缺失。3个分离株之间的同源性为98.6%～99.5%，同源性较高，表明我国广西、河南、山东地区均存在韩国N-DHV的流行。

2.10 遗传进化分析 对VP1蛋白氨基酸序列进行比对，绘制遗传进化树，结果表明GX株、HN株和LZ株与DHV-C处于同一分支，亲缘关系较近，但为不同小分支，表明我国分离的DHV-C与韩国分离的DHV-C存在一定差异性，并且与DHV-B相邻，而与DHV-A处于明显不同的分支(图5)。

3 讨 论

RT-PCR作为一种分子生物学检测技术，具有灵敏度高、特异性强、快速等优点，本实验首先采用RT-PCR技术对分离株进行鉴定，并与DHV-1阳性血清进行交叉中和试验，结果表明DHV-1阳性血清不能中和分离株，因此分离株不属于DHV-1，与DHV-1无血清学相关性。动物回归试验结果表明3个分离株的死亡率不同，分离株的毒力存在一定差异。将分离株接种11日龄SPF鸡胚，鸡胚发育正常，再返传鸭胚，鸭胚也发育正常，未发生死亡，表明分离株不能在鸡胚中增殖，这与苏敬良报道N-DHV不能在鸡胚中增殖相一致。

目前，已有学者对N-DHV的基因组全序列进行分析，发现N-DHV的VP1蛋白多暴露于病毒表面，包括了大部分的插入与缺失片段和高变异区，是决定病毒抗原性的主要成分，它能够诱导动物产生中和抗体。VP1蛋白的差异体现了我国N-DHV的流行特点[8-11]。因此，通过对VP1蛋白的核苷酸与氨基酸序列同源性的比较，分析该高变区，这对DHV的遗传变异的研究具有指导意义。本研究通过对VP1蛋白的分析，为N-DHV分子流行特点的进一步研究以及该病的防制提供依据。

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