胃癌组织中Livin与Caspase-9的表达及临床意义

刘满华 田 蕾 郭连怡 李 舒 (辽宁医学院附属第一医院消化内科，辽宁 锦州 121000)

凋亡是肿瘤发生的重要机制，凋亡通路的紊乱、促进凋亡因子的抑制、凋亡抑制因子的过表达以及凋亡基因的表达失控，都会导致肿瘤的发生、发展。Livin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成员，特异高表达于多种实体肿瘤组织和肿瘤细胞系，能抑制许多凋亡刺激诱发的细胞凋亡〔1〕。Caspase-9是一种促凋亡因子，属于凋亡蛋白家族，是Caspase系统引起细胞凋亡的最关键成分之一。为探讨两者对胃癌发生发展的影响，本实验应用免疫组织化学方法检测胃癌中Livin基因的表达及其与Caspase-9的关系，旨在探讨二者在胃癌发生发展过程中的作用，从而为胃癌的诊断与临床治疗提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集辽宁医学院附属第一医院2010年1月至2010年10月胃癌手术切除标本78例，其中男48例、女30例，年龄42～76岁，中位年龄64岁。所有患者均经术中快速冷冻切片和常规病理诊断确诊，术前均未接受化疗、放疗或免疫治疗。按照国际抗癌联盟(UICC)TNM分期:Ⅰ期14例，Ⅱ期28例，Ⅲ期36例，无Ⅳ期病例。组织学分级高分化3例，中分化22例，低分化33例，未分化20例。其中伴有淋巴结转移者49例，无淋巴结转移者29例。随机选取30例胃溃疡患者胃黏膜组织作为对照。

1.2 试剂 Livin兔抗人多克隆抗体(稀释浓度1∶200)、Caspase-9兔抗人多克隆抗体(稀释浓度1∶100)为武汉博士得生物工程有限公司产品，PV-6000免疫组化试剂盒和DAB显色剂购自北京中杉金桥技术有限公司。

1.3 方法 采用免疫组织化学PV-6000两步法。标本离体后迅速用10%甲醛溶液固定、常规脱水、石蜡包埋，制成4 μm厚连续冷冻切片，二甲苯脱蜡至水，蒸馏水冲洗，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液高压抗原修复2 min后自然冷却至室温，3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗2 min×3次。滴加一抗，4℃冰箱过夜，PBS冲洗2 min×3次，滴加生物素标记二抗(鼠抗兔IgG多聚体)37℃温箱内孵育30 min，PBS冲洗2 min×3次，DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，盐酸乙醇分化，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。以PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 Livin可以表达于细胞质和/或细胞核，Caspase-9表达于细胞质。每张切片随机选择5个高倍视野，每个高倍镜视野计数100个细胞，采用半定量积分法依据染色强度和阳性细胞百分率判断染色结果。按染色强度评分:无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分;按阳性细胞百分率评分:无阳性细胞0分，阳性细胞百分率＜10%1分，10% ～49%2分，50% ～74%3分，75% ～100%4分。2项评分乘积≥3分为阳性，＜3分为阴性。结果判定采用双盲法，由2名有经验的临床病理医师认定。

1.5 统计学方法 实验数据用SPSS17.0统计软件分析，各组间率比较采用 χ2检验，两指标阳性表达之间的关系采用Spearman等级相关性检验。

2 结果

2.1 Livin在胃癌组织及对照胃组织中的表达情况 在78例胃癌组织中有42例Livin蛋白表达阳性，14例Caspase-9表达阳性，而30例对照胃组织中仅有4例Livin蛋白表达，Caspase-9表达阳性为17例。Livin主要出现在肿瘤组织中，间质细胞及临近正常组织中不表达，见图1，Caspase-9的表达主要位于胞质，见图1。Livin在胃癌组织中的阳性表达率明显高于对照组中的阳性表达率，而Caspase-9在胃癌组织中的阳性表达率明显低于对照组中的阳性表达率，二者的差异均具有统计学意义(P ＜0.01)，见表1。

图1 各组Livin及Caspase-9的表达(DAB，×400)

表1 Livin与Caspase-9在胃癌及对照胃组织中的表达(n)

2.2 Livin与Caspase-9在胃癌中的表达与临床病理参数的关系 Livin与Caspse-9蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤大小均无相关性(P＞0.05)。Livin与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期呈正相关(P＜0.05)，随着肿瘤浸润深度的增加、淋巴结转移的发生和临床分期的的提高而增加;与肿瘤的病理分化程度负相关，随着肿瘤病理分化程度的提高而降低。而Caspase-9与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期呈负相关(P＜0.05)，随着肿瘤浸润深度的增加、淋巴结转移的发生和临床分期的的提高而降低;与肿瘤的病理分化程度正相关，随着肿瘤病理分化程度的提高而增加。见表2。

2.3 胃癌组织中Livin与Caspase-9表达的关系 42例Livin蛋白表达阳性的胃癌组织中有3例Caspase-9蛋白表达阳性，36例Livin蛋白表达阴性的胃癌中有11例Caspase-9表达阳性，Livin与Caspase-9的表达呈负相关(P＜0.01，r=－0.304)。

表2 Livin与Caspase-9在胃癌中的表达与临床病理参数的关系

3 讨论

凋亡或细胞程序性死亡是具有独特形态学和生物学特征的细胞死亡的一种遗传机制〔2〕。细胞凋亡是机体重要的生理过程，起着维持内环境稳定的关键作用。近来一些研究表明，凋亡在肿瘤的发生中也扮演着重要的角色。

IAPs是近年来备受瞩目的一类蛋白家族，其抑制凋亡的多样性高于已发现的其他凋亡抑制因子家族。Livin是新发现的凋亡抑制蛋白，N端仅包含一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列BIR结构，C端含一个RING环指结构。Livin的主要作用是抗细胞凋亡，目前的研究认为它主要通过其BIR区与Caspase结合启动以阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径，从而抑制凋亡蛋白酶的活性。研究显示Livin在很多人类恶性肿瘤中高表达，如黑色素瘤〔3〕、肾癌〔4〕、大肠癌〔5〕、非小细胞肺癌〔6〕、胃癌〔7〕等，提示该基因可能在肿瘤的发生发展中起重要的作用。本实验结果表明，Livin在胃癌组织中的阳性表达率明显高于非胃癌组织，二者比较有显著性差异(P＜0.01)。本文研究还发现，Livin蛋白在有淋巴转移患者中阳性表达率高于无淋巴结转移者(P＜0.01)，提示Livin除抑制细胞凋亡之外还可能促进肿瘤细胞增殖。另外，Livin与肿瘤浸润深度、临床分期呈正相关，与肿瘤的病理分化程度呈负相关(P＜0.05)，随着肿瘤病理分化程度的降低而增高，提示Livin蛋白的持续表达可能进一步参与胃癌的恶性演进过程，而且极有可能成为反映胃癌恶性程度的参考指标之一。

Caspase是一组半胱氨酸蛋白酶家族，多数Caspase正常以非活性的前体即Caspase酶原或Procaspase形式存在，在凋亡的调控中发挥着重要作用。根据其在凋亡调控中的不同作用，Caspase家族可以分为凋亡的启动者和凋亡的执行者〔8〕。Caspase-9是Caspase家族中最重要的起始因子〔9〕，属于线粒体通路凋亡的启动者，在这个通路中，细胞因为应激，细胞色素C从线粒体中释放入细胞质，与凋亡蛋白激活因子1(Apaf-1)以及Procaspase-9结合，形成凋亡复合体从而导致Caspase-9的活化，进而激活其下游的效应Caspase，如Caspase-3和Caspase-7，从而启动细胞死亡程序。本实验结果显示:Caspase-9在胃癌组织中低表达，而在对照胃黏膜组织中高表达，差异有统计学意义(P＜0.01)。Caspase-9在肿瘤组织中表达下调的原因可能是:机体在致癌因素的作用下进行阴性克隆筛选，Caspase-9表达高的细胞促进肿瘤细胞凋亡，而表达较低水平的细胞则生存了下来。由此，我们可以认为Caspase-9是一种抑癌基因，与Soengas等〔10〕的观点一致，且可能在胃癌的发病过程中扮演着重要的角色。经统计学分析，Caspase-9在胃癌中的表达与淋巴结转移有关，提示Caspase-9活性可能在肿瘤细胞中受抑制，导致凋亡抑制，肿瘤细胞增殖。本研究还发现，Caspase-9阳性表达率与肿瘤浸润深度、临床分期呈负相关，与肿瘤的病理分化程度呈正相关(P＜0.05)，随着肿瘤病理分化程度的增高而增高，低分化胃癌中Caspase-9的表达低于高中分化胃癌，提示低表达Caspase-9可使细胞凋亡减少，因而凋亡与增生失衡，使得癌细胞生长加快。因此，促进Caspase-9蛋白的激活或抑制其降解失活，促进肿瘤细胞凋亡，是抑制胃癌的有效方法。Caspase-9可能成为胃癌临床诊断、判断疗效及监测预后的可靠指标。

在本研究中，Livin和Caspase-9在胃癌组织中表达具有相关性，二者表达呈负相关(P＜0.01，r=－0.304)，表明Livin抑制细胞凋亡可能与其抑制Caspase-9有关，而且二者的表达与淋巴结转移、肿瘤浸润深度、临床分期及病理分化程度有关，由此推测Livin可能通过某种信号传导途径抑制Caspase-9的活性，从而抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖，引起胃癌的发生、发展。Kasof等〔11〕研究证明Livin可以和下游Caspase的活性形式Caspase-3和Caspase-7直接作用，Livin的BIR结构能够与Caspase结合而抑制后者的功能。Livin也可以直接抑制Procaspase-9的活化过程，使无活性的Procaspase-9不能活化成有活性的Caspase-9，而且Livin也可以直接抑制活化的Caspase-9的功能从而发挥抗凋亡的作用〔12〕。

但胃癌的发生、发展是多基因共同参与、相互综合作用的结果，并且参与调控的基因蛋白形成网络、相互影响，有哪些因素可以诱导Livin基因表达，其调节过程与哪些信号传导通路有关，Livin在抗凋亡中的作用以及调控Caspase-9基因的确切作用机制还有待进一步研究。

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3 Schmollinger JC，Vonderheide RH，Hoar KM，et al.Melanoma inhibitor of apoptosis protein(ML-IAP)is a target for immune-mediated tumor destruction〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(6):3398-403.

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9 Shi Y.Apoptosome:the cellular engine for the activation of caspase-9〔J〕.Structure，2002;10(3):285-8.

10 Soengas MS，Alarcon RM，Yoshida H，et al.Apaf-1 and caspase-9 in p53-dependent apoptosis and tumor inhibition〔J〕.Science，1999;284(5411):156-9.

11 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member〔J〕.Biol Chem，2001;276(5):3238-46.

12 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas〔J〕.Curr Biol，2000;10(21):1359-66.