NF-κB信号通路与骨质疏松

吴昆鹏 戴永武 杨巧珠 马凤燕 刘 义 (广东医学院，广东 湛江 524000)

核因子Kappa B(NF-κB)最初发现是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异结合并调节κ轻链转录的核蛋白因子。随后发现NF-κB参与细胞生长、分化及炎症反应等基因表达调控〔1，2〕，同时研究表明在很多常见的情况下出现NF-κB的异常激活或抑制，如肿瘤、糖尿病、动脉粥样硬化等，这些都表明NF-κB无论是在正常还是疾病状态下都扮演着重要的角色〔3〕。骨质疏松(OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。OP发生是由于骨形成和骨吸收的失衡，大量研究表明，NF-κB信号通路不仅在骨形成和骨吸收起着重要作用，而且通过与其他信号通路相互联系，彼此作用，影响OP的发生。因此，我们就NF-κB信号通路在成骨细胞和破骨细胞中的作用进行综述。

1 NF-κB 信号通路

哺乳动物的NF-κB家族包含5个成员:RelA(p65)，p50，p52，RelB，和c-Rel。这些成员均在N端含有Rel同源结构域，并以同源或异源二聚体形式存在，能特异地和DNA发生结合。RelA，RelB和c-Rel在C端有一个转录激活区(TAD)，p50和p52没有TAD转录激活区，必须依靠和其他转录因子共同作用来调节基因的转录。p50和p52由分子量相同的蛋白质组成，NF-κB1(p50)由 p50 和其前体 p105 组成，NF-κB2(p52)由 p52和其前体p100组成〔1〕。在许多情况下，RelA、c-Rel和 p50形成异源二聚体通过经典途径产生信号表达，如RANKL、TNF-α、IL-1刺激〔4〕。RelB、p100与经加工处理后的p52形成异源二聚体，RANK的激活是通过非经典途径产生信号表达，但与肿瘤坏死因子α受体的激活无关〔5〕(如图1)。

NF-κB在基因的调节表达的功能是多方面的，NF-κB二聚体与其NF-κB抑制因子(IκB)家族的成员结合，以无活性的三聚体形式存在于胞浆中。经典的 IκB家族成员有 IκBα，IκBβ，IκBε〔6〕。它们均有锚蛋白重复序列，通过与 NF-κB 二聚体结合而干扰核定位信号。IκBα主要通过经典旁路途径调节Rel/p50异源二聚体。p60/p50异源二聚体普遍存在于哺乳动物中，所以通常所指的NF-κB即是p60/p50。IκBε主要调节RelA/RelA同源二聚体和c-Rel/RelA异源二聚体〔3〕，并对RANKL和TNF-α的刺激产生应答。IκBα蛋白酶体的迅速降解而暴露出NF-κB/p65亚单位上的核转位信号，使得NF-κB进入核内并与调节细胞因子基因的增强子区相结合，从而启动这些基因的转录过程。诱导NF-κB表达的不仅包括细胞因子，酶和生长因子，也有包括由细胞核返回胞质为下一次激活作准备的RelA/p50异源二聚体所形成的负反馈调节〔3〕。

经典的NF-κB信号的刺激活化主要通过由催化亚单位IKKα，IKKβ和调节亚单位 IKKγ〔也称NEMO(NF-κB基本调节基因)〕〔3，7〕。IKK 复合物磷酸化产生 IκBα，引导其聚泛素化和通过26S蛋白酶降解使RelA/p50二聚体发生核移位〔8〕。IKKβ在大部分的细胞里主要通过经典途径调解IκB激酶的活化。相比之下，NF-κB旁路途径信号的活化主要通过NF-κB诱导激酶激活 IKKα，引导 p100的加工处理，产生 p52/RelB二聚体〔9～11〕。经典的IKK信号另一个重要的效应通过旁路途径上升表达NF-κB2基因〔12〕。在下文会提及，p100在 TNFα诱导破骨细胞形成有重要的抑制效应。

NF-κB的活化在胚胎发展期间调节软骨内小骨的形成，在某些病理条件下对骨骼产生影响，包括绝经后OP，炎症，骨关节炎，感染和转移性骨病等〔13〕。研究资料表明NF-κB对骨骼的影响主要通过诱导增强破骨细胞的形成和活化，但在成骨细胞也有着重要的作用，将会在下文进行阐述。

图1 TNF-α和RANKL分别通过经典和非经典通路活化 NF-κB〔14〕

2 NF-κB在破骨细胞中的作用

破骨细胞在维持骨吸收和骨形成的动态平衡中起着重要的作用，而NF-κB活化被认为是成熟破骨细胞存活〔15〕和发挥功能〔16〕的重要调节因子。NF-κB 家族5个成员中，NF-κB1 和NF-κB2在骨中的作用最早被发现。在NF-κB1/2双基因敲除小鼠模型中意外地发现这种小鼠不能萌牙，并患有由于缺少破骨细胞导致的骨骼硬化症〔17，18〕。此外，NF-κB1/2双基因敲除小鼠与RANKL-RANK双基因敲除小鼠的破骨细胞分化障碍相似，它们的破骨前体细胞都停止在分化阶段，并且不能够表达破骨细胞分化的重要作用因子，如:TRAP、组织蛋白酶K、降钙素受体等。正常情况下许多细胞的存活都需要NF-κB的表达，研究发现这种NF-κB1/2双基因敲除小鼠的破骨前体细胞数量增加，但是凋亡没有增加〔19〕。TNF、LI-1、IL-6 和 RANKL 等细胞因子能够促进破骨前体细胞向破骨细胞分化，但是这些细胞因子不能促进NF-κB1/2双基因敲除小鼠的破骨前体细胞分化〔20〕，而 NF-κB1 和 NF-κB2 的单基因敲除小鼠破骨细胞形成正常，并且能增加IL-1促进破骨细胞形成的作用〔20〕，由此可见，在破骨细胞中NF-κB1/2主要作用是调控细胞的分化，并且经典和非经典的NF-κB信号通路在TNF，RANKL，IL-1等诱导破骨细胞形成中起着重要的作用。

C-Rel表达不是RANKL诱导破骨细胞形成所必需的，但是，大部分C-Rel基因敲除小鼠关节的炎症因子表达和骨磨损明显减少。RelA基因敲除小鼠的成骨前体细胞中C-Rel的活性没有变化〔21〕，因此表明C-Rel与RelA在破骨细胞中执行不同的功能。

研究表明破骨细胞形成过程中IKKβ必需的，而IKKα不是必需的。IKKβ基因敲除小鼠存在破骨细胞形成的障碍，而IKKα基因敲除小鼠的骨骼发育和破骨细胞数量都正常。RANKL不能刺激IKKβ基因敲除的小鼠的成骨前体细胞分化成破骨细胞，而TNF或IL-1能够使其分化成破骨细胞〔22〕。有实验表明，NIK不是破骨细胞形成必要的，但是RANKL完全不能诱导NIK基因敲除小鼠的破骨前体细胞向破骨细胞分化〔23〕。RelB基因敲除小鼠有轻度的破骨细胞形成障碍，并且与NIK基因敲除小鼠的破骨前体细胞一样对RANKL诱导分化作用无应答〔24〕。因此RANKL/RANK信号通路促进破骨细胞形成是通过非经典途径活化NF-κB来完成的。

有实验显示，破骨细胞的形成是一个阶段性的过程，RANKL诱导破骨前体体细胞分化过程中，RANKL作用在1 h内发现RelA和P50有短暂而快速的增加〔25〕，在作用48～72 h期间，主要是NFATc1，c-Fos表达，而作用72～96 h期间，RelA和p50没有变化，这些实验只是在转录水平的研究，它们在蛋白质水平上的改变有待进一步研究〔26〕。曾有学者认为OPG/RANKL/RANK信号通路，是影响破骨细胞增殖、分化、功能调节的最主要途径，但是目前大量研究表明，TNF-α作用于破骨前体细胞后能观察到NF-κB，c-Fos，NFATc1活性改变，其诱导破骨前体细胞的分化作用不是通过RANKL/RANK信号通路〔26～29〕。RANKL 和 TNF-α 通过相似的途径激活 NF-κB，c-Fos，NFATc1〔26，28〕，而 且 NF-κB，c-Fos，NFATc1 的 表 达 是RANKL和TNF-α促进破骨细胞分化必不可少的。NF-κB，c-Fos，NFATc1位于 RANKL的下游，NF-κB抑制剂能够阻断RANKL和 TNF-α 促进骨吸收的作用〔14〕。TNF-α 和 RANKL诱导的破骨细胞形成作用机制研究显示，TNF-α在体外能够诱导RANK基因敲除小鼠破骨前体细胞向破骨细胞分化，但是体内实验不能诱导RANK基因敲除小鼠破骨细胞的形成〔30〕。在促进破骨细胞形成的作用中，TNF-α与RANKL都能够促进p100的表达，与RANKL不同的是TNF-α只能将少量的p100转化为p52，而导致细胞质中有大量的 p100〔31〕。TNF-α 与 RANKL 促进NF-κB2基因敲除小鼠破骨细胞形成的作用效果一样〔28〕，Yao等为了确定P100是否能够抑制RANK基因敲除小鼠破骨细胞形成，通过TNF-α作用于RANK单基因敲除小鼠和NF-κB2/RANK双基因敲除小鼠，结果发现RANK单基因敲除小鼠只有少量的破骨细胞形成，而NF-κB2/RANK双基因敲除小鼠有大量的破骨细胞形成〔28〕。Tanaka研究也证明NF-κB p100能够抑制 TNF-α促破骨细胞形成作用〔32〕。体外实验显示，TNF-α能够促进破骨前体细胞细胞膜上的RANK和c-Fms表达，从而放大 RANKL 和 M-CSF 信号〔33，34〕。总体而言，TNF-α与RANKL促进破骨细胞形成与NF-κB信号通道有密切关系，而TNF-α与RANKL能共同促进破骨细胞形成，但是也同时存在差异，而这种差异主要是由于对它们诱导p100向p52转化的数量不同。

3 NF-κB在成骨细胞中的作用

成骨细胞增殖分化的抑制或成骨细胞凋亡进程的加速，能使骨形成少于骨吸收从而导致OP的发生〔35，36〕，而 NF-κB信号通路在成骨细胞的增殖分化和凋亡过程中都有着重要的作用。早期研究表明，NF-κB p50/p52基因敲除的小鼠没有破骨细胞的形成，并且成骨前体细胞增多〔37〕。Chang等〔38〕的实验表明NF-κB的特异性抑制剂IKK-DN和SR-IκBα能促进骨髓间质细胞C2C12向成骨细胞分化并引起Fra-1表达增多，体外实验证实Fra-1是细胞外基质沉淀和骨形成的关键因子〔39，40〕。此外，当NF-κB p65高表达时能够抑制多个成骨关键因子(如:Runx2、sp7、ALP、Ibsp、coll2)的表达和细胞外基质的矿化〔38〕。在卵巢切除的大鼠OP模型中，能看到NF-κB在成骨细胞中异常的活化，目前研究表明，导致NF-κB异常活化的途径有2种，分别是:①正常情况下，雌激素与雌激素受体结合能抑制NF-κB的表达，在卵巢切除的OP模型中由于缺乏足够的雌激素与雌激素受体结合导致 NF-κB的异常活化〔41〕;②OP时，T细胞和其他细胞高度表达炎症细胞因子如:TNF-α、IL-6、IL-1等，能促进成骨细胞中 NF-κB 活化〔42〕，活化的 NF-κB 同时能促进TNF-α、IL-6、IL-1 的转录，使其表达增加〔43〕，NF-κB 与炎症细胞因子形成一个循环放大的过程。大量NF-κB的活化，使骨形成受抑制，导致OP发生。有实验进一步证实NF-κB在雌激素维持骨平衡中起着重要作用，在成骨细胞MC3T3中，17β-雌二醇对NF-κB基础活性没有影响，17β-雌二醇明显抑制TNF-α诱导的NF-κB，说明雌激素能够维持NF-κB的活性在一个正常的水平，从而有利于成骨细胞的增殖分化〔44〕。

正常培养的大鼠成骨细胞上有少量Bcl-2、Bax和Fas的表达，其表达并不随培养时间的延长而有所变化。目前研究显示Bax的过度表达可以诱导成骨细胞的凋亡〔45〕，而Bcl-2蛋白可以和Bax蛋白相结合抑制细胞凋亡，而Bcl-2的升高并不伴随Bax水平的改变〔46〕，因此Bcl-2/Bax的比值可用于估计细胞接受凋亡信号后存活与否〔47〕。TNF-α作用于成骨细胞时的Bax表达强于Bcl-2，成骨细胞凋亡增加，同时NF-κB表达也增加，但是有研究显示在Bcl-2的启动子有多个NF-κB结合位点，NF-κB 活化时可以上调 Bcl-2 表达，下调 Bax〔48，49〕。同时还有实验显示NF-κB抑制剂能通过减少 Bcl-2表达导致细胞凋亡〔50，51〕。因此，我们推断 TNF-α 诱导成骨细胞凋亡发生不是通过NF-κB信号通路，而NF-κB活化的主要作用是通过上调Bcl-2来抑制细胞的凋亡。总体而言，目前国内外关于NF-κB信号通路在成骨细胞用研究较少，NF-κB信号通路在骨形成中的作用还不十分明确，因此，研究NF-κB信号通路对成骨细胞增殖分化的影响有十分广阔的空间。

4 总结

从这些研究资料表明经典和旁路的NF-κB信号通路对成骨细胞，破骨细胞增殖，分化有着非常重要的作用。一方面，NF-κB高表达导致破骨细胞增多，骨吸收的增强和抑制成骨细胞的增殖分化，骨形成减少。另一方面，部分NF-κB家族的成员只会在疾病发生的时候表达，例如:Rel B在破骨细胞中的表达。因此，通过研究NF-κB信号通路在OP中的作用，不仅有助于阐明OP的发病机制，同时为临床上开发抗OP药提供新的研究靶点，也将为今后进一步探讨其治疗措施提供新的思路。

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