丹参酮ⅡA对动脉粥样硬化大鼠VCAM-1表达的影响

黎洪展 吕永恒 陈 琪 黄光胜 (南方医科大学中医药学院，广东 广州 510315)

目前研究认为动脉粥样硬化(AS)过程不仅仅是脂质在动脉壁中的聚积，而且是一种慢性炎症性疾病，多种炎性细胞因子的过度释放是形成的重要步骤已经被广泛接受〔1〕。近几年研究发现作为黏附分子家族中的重要一员血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)参与了AS的形成过程〔2〕，丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA，Tsn)具有逆转AS的作用〔3〕。本研究旨在探讨Tsn对试验性大鼠AS形成及主动脉VCAM-1表达的影响，为AS的防治及丹参类中药的临床应用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物分组及给药 健康SD雄性大鼠，30只，体质量(180±10)kg。将大鼠随机分为3组:正常对照组、模型组和Tsn组，每组10只。大鼠适应性饲养后，除正常对照组外，各组按50万IU/kg的总剂量灌胃给予维生素D3，分3 d给完，正常对照组，仅饲以普通柱状大鼠标准饲料;其余各组进食高脂饲料:大鼠标准饲料83%，胆固醇2%，猪油10%，白砂糖5%，每天每只给予15 g高脂饲料，期间全部自由饮水。给予高脂饲料4 d后，开始灌服丹参酮ⅡA每日10 mg/kg灌服，空白组和模型组每天灌服双蒸馏水5 ml/kg，12 w后实验。

1.2 主要实验试剂和仪器 丹参酮ⅡA(纯度85%)购自上海第一生物化学药业有限公司;VCAM-1单克隆抗体(1∶100)，购自武汉博士德生物工程公司。即用型SABC免疫组化试剂盒(含生物素标记山羊抗兔/大鼠IgG二抗和辣根过氧化物酶标记链霉菌卵白素工作液)和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;苏丹Ⅲ为天津市大茂化学试剂厂产品;荷兰威图全自动生化分析仪;LeicaRM2125切片机和LeicaDME321058943PX显微摄像机由德国徕卡公司生产;OLYMPUS CH20BIMF200-2显微镜由日本奥林巴斯公司生产。

1.3 方法

1.3.1 血脂测定 第12周末从眼眶取血，取血前禁食12 h，离心，取血清，在自动化生化仪上测定血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.3.2 主动脉病变病理检查 试验结束后，予0.6 ml/kg速眠新后肢外侧肌肉注射麻醉大鼠，于无菌条件下迅速取出主动脉，剥净外膜和周围脂肪，沿背侧正中线纵向剪开，用0.9%生理盐水冲洗干净，平铺于滤纸上，用15%中性甲醛固定。苏丹Ⅲ染色，用500万像素的数码照相机近距离照相，采用全自动图像分析系统(Penguin2600CL DX51TR美国)计算管腔面积、新生内膜面积及内膜增生百分比。HE染色，在显微镜下观察主动脉的壁厚度、内膜泡沫细胞的含量、内膜炎症、内膜脂质沉积程度的变化。

1.3.3 主动脉VCAM-1免疫组织化学染色 在胸主动脉中段定位切取2 mm×5 mm组织，制石蜡切片，PBS洗3次，每次3 min，按免疫组化试剂盒说明进行免疫组化染色，在显微镜高倍视野下观察分析阳性结果，采用图像分析系统，以阳性表达的百分率半定量分析VCAM-1表达的强弱。

1.4 统计学方法 采用 SPSS10.0统计软件，结果以±s表示，组间差异采用单向方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果

2.1 血脂检查结果 高脂饮食组、高脂饮食加丹参酮高、中、低剂量组TC、TG、LDL-C水平较对照组显著升高(P＜0.01)。高脂饮食组与Tsn组血清TC、TG、LDL-C水平差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

2.2 主动脉病理学改变 肉眼可见对照组内膜光滑，无斑块形成。高脂模型组血管表面不光滑，凹凸不平，大量黄白色斑块突出于管腔表面，并连接成片，尤以近主动脉弓处及血管开口处最为明显。HE染色可见模型组的内膜显著增厚，内膜不完整，内皮下腔隙增大，内含大量泡沫细胞，中弹力纤维增粗，弹力纤维和胶原纤维排列紊乱。组主动脉内膜厚度较模型组显著变薄，病理改变减轻，只偶有少量的脂质沉积、散在的泡沫细胞和炎症细胞。与对照组相比，模型组管腔面积减小、新生内膜面积增大、内膜增生百分比增大(P＜0.001)。与模型组相比，Tsn组管腔面积增大、新生内膜面积减小、内膜增生百分比减小(P＜0.05)。见表2。

2.3 主动脉VCAM-1免疫组化检测 VCAM-1在模型组的表达为(33.67±5.43)%，较对照组的(0.55±0.25)%明显增高(P＜0.01)，VCAM-1在Tsn组的表达为(18.29±2.52)%，较模型组降低(P＜0.05)。见图1。

表1 各组血脂检测结果(mmol/L，±s)

表1 各组血脂检测结果(mmol/L，±s)

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

TC TG LDL-C对照组组别 n 10 2.21±0.35 1.09±0.38 1.05±0.17模型组 10 28.29±0.871) 4.70±2.231) 9.32±0.291)Tsn组 10 22.54±1.431)2) 3.87±1.311)2) 8.52±0.511)2)

表2 各组主动脉内膜增生情况比较(±s)

表2 各组主动脉内膜增生情况比较(±s)

与对照组比较:1)P＜0.001;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 n 管腔面积(×104μm2)新生内膜面积(×104μm2)内膜增生百分比(%)10 4.37±0.72 3.05±1.03 40.7±10.4模型组 10 2.56±0.251) 4.58±1.301) 63.2±7.41)Tsn组 10 3.96±0.452) 3.38±1.102) 45.2±8.92)对照组

图1 主动脉VCAM-1的表达(DAB，×200)

3 讨论

AS是血管内皮细胞、平滑肌细胞受到血脂异常、高血压及病毒感染等多种损伤性因素直接作用后，出现内皮损伤，并导致过度炎症性纤维增生性反应的结局。血浆中 TC、TG、LDL过高都是AS的危险因素。本实验结果显示，模型组大鼠经高脂饮食后，TC、TG、LDL-C显著升高，主动脉可见明显AS斑块形成，病理切片见血管内皮下脂质浸润等指标，证明本实验AS模型已成功建立;Tsn不能降低大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，但该组主动脉内膜脂质斑块面积较模型组有显著性减少，病理切片显示Tsn组主动脉内膜厚度较模型组显著变薄，病理改变减轻，只偶有少量的脂质沉积、散在的泡沫细胞和炎症细胞，说明Tsn能显著、有效地抑制动脉脂质沉着，阻止AS形成。

VCAM-1是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管内皮细胞表达，已知正常动脉内皮细胞不表达VCAM-1，当其受到炎症介质或其他刺激时才会表达。VCAM-1参与了AS发生、发展全过程。在高血脂刺激AS形成过程中，VCAM-1早期表达，促使白细胞、巨噬细胞的活动性、黏附力和转移力增强，使单核细胞黏附、迁移并转化为巨噬细胞，摄取脂质转化为泡沫细胞，同时还可促进T淋巴细胞及B淋巴细胞从血流中向内皮细胞的黏附〔2，4〕。硬化晚期，VCAM-1参与了局部炎症的激化、巨噬细胞的活化与聚集、分泌基质金属蛋白酶降解纤维帽的细胞外基质成分等过程〔5〕。抑制VCAM-1的表达，可以减轻或延缓AS病变的发生和发展〔6〕。我们的研究发现，AS模型组主动脉可见大量VCAM-1阳性表达细胞，并且主要表达于病变血管的内皮及斑块中，而Tsn能明显抑制AS大鼠主动脉VCAM-1的表达，从而抑制了AS时炎症细胞趋化、黏附与迁移，抑制AS时局部炎症反应而达到防治AS的作用。

1 Galkina E，Ley K.Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis〔J〕.Annu Rev Immunol，2009;27(1):165-97.

2 Kaufmann BA，Sanders JM，Davis C，et al.Molecular imaging of inflammation in atherosclerosis with targeted ultrasound detection of vascular cell adhesion molecule-1〔J〕.Circulation，2007;116(3):276-84.

3 周明学，徐 浩，陈可冀.活血、益气、化痰中药对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化斑块炎症反应的影响〔J〕.中国中医急症，2008;17(4):496-8.

4 Rueda-Clausen CF.Inflammation but not endothelial dysfunction is associated with the severity of coronary artery disease in dyslipidemic subjects〔J〕.Mediators Inflamm，2009;23(4):469-79.

5 Matheny HE，Deem TL，Cook-Mills JM.Lymphocyte migration through monolayers of endothelial cell lines involves VCAM-1 signaling via endothelial cell NADPH oxidase〔J〕.J Immunol，2000;164(12):6550-9.

6 Zhu LQ，Wang SR，Qin Y.Effects of huoxue injection on the adherence of human monocytes to endothelial cells and expression of vascular cell adhesion molecules〔J〕.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2009，29(3):238-41.