银杏叶提取物EGb761对铜与高胆固醇共处理家兔主动脉病变的影响

张瑞峰 马东明 姜希娟 卢 斌 苏金玲 郭茂娟 (天津中医药大学病理教研室，天津 30093)

Sparks等〔1〕在研究高胆固醇血症与阿尔茨海默病(AD)发病的关系时发现，以添加微量铜离子的蒸馏水代替自来水后，给予高胆固醇饮食的家兔，AD的形态和病理表现更突出。高脂血症尤其是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量的升高，已经成为公认的致动脉粥样硬化(AS)的危险因素。我们在研究中发现铜与高脂饲养的家兔主动脉存在明显的动脉粥样硬化病变，银杏叶提取物EGb761对这一病变具有一定的保护作用。银杏叶提取物EGb761是按德国Schwabe专利工艺利用醇溶液从银杏科植物银杏叶中提取的有效成分，主要含有24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯，后者含5种银杏内酯(ginkolides A、B、C、M、J)和白果内酯。近年来研究发现银杏叶提取物具有一定的降脂作用。本研究将对银杏叶提取物EGb761对铜和高胆固醇引起的动脉粥样硬化的作用及其机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 银杏叶提取物EGB761(商品名:金纳多)，德国威玛舒培博士药厂，批号:9840808;胆固醇，分析纯，天津市英博生化试剂有限公司，批号:090423;血清总胆固醇(TC)测定试剂盒，批号:090801;总甘油三酯(TG)测定试剂盒，批号:093071;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒，批号:090806;LDL-C测定试剂盒，批号:090080;均由中生北控生物科技股份有限公司提供。丙二醛(MDA)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，批号:20090730;Trizol®Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)试剂盒、Oligod(T)16，High capacity cDNA Re-verse Transcription Kit试 剂 盒 (Applied Biosystems、P/N:4368814)，Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems、P/N:4367659)、PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.2 主要仪器 722分光光度计，Image-Proplus图像分析系统，HYBAIDPE480反转录仪，ABI7300实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)仪等。

1.3 方法

1.3.1 实验动物模型的建立与分组 健康成年雄性新西兰大白兔(军事医学科学院实验动物中心提供)27只，体质量(2 356±212)g，在温度(28±2)℃，湿度37% ～48%，12 h交替照明的清洁环境中给予普通饲料和自来水适应喂养2 w后，随机取出9只作为对照组，采用普通饲料和蒸馏水喂养，直至实验结束，共9 w。其余家兔参照D.Larry Sparks等〔1〕的方法:给予2%高胆固醇饲料和含0.12×10－6铜离子(以硫酸铜的形式)的蒸馏水造模。6 w后，造模家兔死亡1只，将造模成功家兔随机分为模型组(由于停用胆固醇后，家兔血清胆固醇水平会很快降低，因此，6 w后继续给予高胆固醇饲养3 w，作为模型组，n=9)和 EGB761 组(EGB761 50 mg·kg－1·d－1灌胃 3 w，其余处理同模型组，n=8)。上述给药剂量为“按照成人体表面积折算的等效剂量”。

1.3.2 标本获取与处理 实验结束时禁食12 h，耳缘静脉取血，分离血清，于－20℃下保存备用。戊巴比妥钠(25 mg/kg)静脉麻醉后，迅速分离自心脏到髂动脉分叉处之间的主动脉，将动脉周围的脂肪组织剔除干净，纵向剖开，生理盐水洗净后苏丹Ⅲ染色，数码相机照相，采用Image-Proplus图像分析系统测量斑块面积占主动脉总面积的百分比。并于主动脉弓处取直径3 mm的组织作HE染色。于肝脏相同位置取约100 mg组织块，液氮保存备用。

1.3.3 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和MDA水平测定 采用酶比色法测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，硫代巴比妥酸(TBA)法测定血清MDA水平，具体操作依试剂盒说明进行。

1.3.4 RT-PCR法测定肝LDLR和LRP1 mRNA表达 用Trizol试剂盒抽提肝组织总RNA，采用紫外分光光度计定量并检测RNA纯度。按逆转录试剂盒要求将总RNA逆转录成cDNA。特异性引物序列，GAPDH，F:5'-TCTCTCAAgATTgTCAg-CAACg-3'，R:5'-CTTCACAAAgTggTCATTgAgg-3';LDLR，F:5'-CAAgCCCAgggCCATCgTggTg-3'，R:5'-CACTgAAgATggCTTCgTT-gATg-3';LRP1，F:5'-gCCAgAAgATCgACggCACC-3'，R:5'-TAgACgCTgCCACTgCggTA-3'。反应参数为95℃预变性10 min，95℃变性10 s→60℃延伸1 min，共40个循环。扩增完毕后，运行融解曲线以验证PCR过程中单一扩增产物形成。所有目的基因(target)mRNA含量用比较域值的方法通过相对每个样品的看家基因GAPDH 计算。目的基因量=2－ΔΔCT，ΔΔCT是目的基因和看家基因的循环域值的差值。数据通过对照组进行标化。ΔΔCT=(CTtarget-CTGAPDH)实验组 －(CTtarget-CTGAPDH)对照组。

2 结果

2.1 主动脉病理形态病变 大体标本肉眼观察发现，正常组家兔主动脉壁光滑未见粥样硬化斑块;模型组家兔可见其脂质斑块从升主动脉、主动脉弓处向下延伸，呈不规则片状分布，突出于内膜表面，苏丹Ⅲ染色动脉粥样硬化病变处显示红色;EGB761组主动脉壁斑块形成的程度较低，仅在升主动脉或主动脉弓处可见少量散在分布的脂质斑块。与正常组相比，模型组和EGB761组斑块面积显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组相比，EGB761组斑块面积明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。HE染色显示，正常组血管内膜光滑、连续、内皮完整;模型组家兔主动脉内膜明显增厚，大量脂质斑块形成，脂质斑块肩部可见炎细胞浸润，脂质斑块内可见泡沫细胞聚集，细胞坏死，并有中膜平滑肌萎缩;EGB761组病变与模型组相似，但程度较轻。

2.2 血脂水平改变 与正常组相比，模型组和EGB761组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均显著升高，差别具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组相比，EGB761组LDL-C水平显著下降，差别具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.3 肝组织LDLR和LRP1 mRNA表达 与正常组相比，模型组和EGB761组肝脏LDLR mRNA表达水平均显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。EGB761组肝脏LRP1 mRNA表达，与模型组和正常组相比，均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

2.4 血清MDA水平改变 与正常组相比，模型组和EGB761组血清MDA水平均显著升高，差别具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组相比，EGB761组MDA水平显著下降，差别具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 EGB761对家兔主动脉斑块面积和血清MDA水平的影响(±s)

表1 EGB761对家兔主动脉斑块面积和血清MDA水平的影响(±s)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05;下表同

组别 n MDA(nmol/ml) 斑块面积/主动脉面积(%)正常组 9 2.82±1.171)0模型组 9 39.12±18.082) 54.72±18.11)EGB761组 8 17.98±18.551)2) 32.80±11.411)2)

表2 EGB761对家兔血脂的影响(±s，mg/dl)

表2 EGB761对家兔血脂的影响(±s，mg/dl)

TC TG LDL-C HDL-C组别(n)正常组(9) 50.28±10.822) 66.67±31.862) 0.27±0.132)1.09±0.222)模型组(9)1 390.34±314.721)848.72±226.361)14.37±2.381)5.38±0.431)EGB761组(8)1 512.22±254.161) 737.18±194.351) 8.05±1.411)2) 4.98±0.611)

表3 EGB761对家兔肝脏LDLR和LRP1 mRNA表达的影响(±s)

表3 EGB761对家兔肝脏LDLR和LRP1 mRNA表达的影响(±s)

0.38±0.25模型组 9 0.10±0.021) 0.20±0.10 EGB761组 8 0.10±0.041) 0.68±0.171)2)LDLR LRP1正常组 9 0.60±0.122)组别 n

3 讨论

研究结果显示，银杏叶提取物EGB761能显著减少主动脉粥样硬化面积，具有延缓动脉粥样硬化病变进展的作用，与丰飞等的研究结果一致〔2〕。EGB761对动脉粥样硬化的保护作用，可能与其降低血脂的作用有关。EGB761的降脂作用近年来已被越来越多的实验研究证实。潘洪平等〔3〕发现银杏叶片能显著降低血瘀证模型大鼠的 TG和 LDL-C水平，对 TC、HDL-C无显著作用。丰飞等〔2〕研究发现银杏叶提取物对TC、TG、LDL-C、ox-LDL均有显著的降低作用。张琪等〔4〕研究发现银杏叶提取物能显著降低已形成高脂血症大鼠血浆中的TC、LDL-C，显著升高HDL-C。虽然银杏叶提取物对血清 TC、TG、HDL-C的作用研究结果不一致，但各项研究均显示银杏叶提取物具有降低升高的血清LDL-C的作用。本实验研究结果也证实EGB761具有降低高脂血症家兔血清LDL-C水平的作用。

LDL-C的清除主要在肝脏进行，LDL-C与肝细胞膜上的LDLR结合，在LRP的协助下进入肝细胞被降解清除。研究结果显示EGB761能在转录水平上显著升高LRP1。EGB761降低LDL-C的作用可能是通过促进LRP的表达加速其清除作用实现的。MDA是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，氧化损伤引起MDA生成量的增加，而MDA又可进一步激发细胞多方面的损伤，MDA的量常常可反映机体内的脂质过氧化程度。研究结果显示EGB761能显著降低高脂血症家兔血清MDA水平，与吴小明〔5〕的研究结果一致。苗军等〔6〕的研究结果也显示，银杏提取物具有降低血清及肝组织过氧化脂质的作用。

因此，银杏叶提取物EGB761具有抑制动脉粥样硬化形成的作用。其作用机制可能是通过降低LDL-C水平，抑制脂质过氧化实现的。

1 Sparks DL，Schreurs BG.Trace amounts of copper in water induce betaamyloid plaques and learning deficits in a rabbit model of Alzheimer's disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2003;100(19):11065-9.

2 丰 飞，金伟东，吴 翔.银杏叶提取物对动脉粥样硬化大鼠斑块及血脂水平影响〔J〕.亚太传统医药，2009;5(10):10-3.

3 潘洪平，危华玲，杨嘉珍.复方银杏叶片对血淤证模型高血脂的影响〔J〕.中国医院药学杂志，2009;29(11):865-7.

4 张 琪，马 博，朱玲玲，等.银杏叶提取物对实验性高脂血症大鼠的调脂机制〔J〕.华西药学杂志，2007;22(6):605-8.

5 吴小明.银杏叶提取物对实验性高脂血症及脂质过氧化作用的影响〔J〕.安徽医药，2009;13(5):498-9.

6 苗 军，张馨木，孙 波，等.银杏叶提取物对实验性高脂血症血脂代谢的影响及抗氧化作用〔J〕.中国老年学杂志，2006;26(11):1544-5.