缬沙坦对老龄高血压大鼠肾脏重构及MMP-9、c-fos表达的影响

朱竹先 张子强 苗 华 许冬梅 (山东大学附属山东省千佛山医院肾内科，山东 济南 25004)

高血压导致最直接的损害是靶器官结构功能的损害，是引起各种并发症的病理基础。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在高血压形成、发展及靶器官重构过程中发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂(ARB)阻断RAAS的受体环节。本研究通过应用ARB评价其对老年高血压大鼠RAAS系统及肾脏基质金属蛋白酶(MMP-9)、c-fos表达的影响，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 40周龄自发性高血压大鼠(SHR)20只(上海第二医科大学实验动物中心提供)，清洁级，体重200～250 g，雌雄各半。正常饲养。随机分组(n=10):SHR-C(空白对照组)、SHR-B+L(贝那普利+缬沙坦组)以及老龄Wistar京都大鼠(WKY)对照组。SHR-L 组:缬沙坦 15 mg·kg－1·d－1;SHR-C组和老龄WKY大鼠组均同样给予等量生理盐水。各组大鼠经胃管给药，干预12 w。

1.2 药品及试剂 缬沙坦，杭州默沙东制药有限公司提供。胶原Ⅳ一抗，即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司。MMP-9、c-fos引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 标本留置 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，取肾脏组织，－70℃保存待检测。

1.3.2 免疫组化 应用SABC试剂盒，按照试剂盒说明进行，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片观察。

1.3.3 大鼠肾脏MMP-9、c-fos mRNA检测 取－70℃保存的大鼠肾脏组织，采用Trizol(Invitrogen，USA)匀浆，氯仿-异丙醇法抽提总RNA。

1.3.4 RT-PCR 取总 RNA 1 μg，进行逆转录(RT)反应(TAKARA)，RT产物-20℃保存。PCR引物:β-actin，上游:5'-AAGATCCTGACCGAGCGTGGC-3'，下 游:5'-cagcactgtgttggcatagagg-3'。MMP-9引物:上游:5'-TTTGACAGCGACAAGAAGTGG-3'，下游:5'-AGGGCGAGGACCATAGAGG-3'。c-fos引物:上游:5'-ACCAGTCCGGACCTGCAGTGG-3'，下游:5'-GCGGCATTTGGCTGCAGCCAT-3'。以上引物均为上海生工合成。cDNA的合成和实时荧光定量PCR检测采用SYBR Ex Script RT-PCR Kit(TAKARA)，同时设不加模板cDNA的阴性对照。应用Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪进行扩增，95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，循环40次。扩增完成后从60℃开始升温作熔解曲线验证扩增产物的特异性。

1.3.5 Western印迹杂交 取肾脏组织中加入湿重组织体积的3～5倍体积的组织裂解液提取总蛋白，取10 μg蛋白提取液用考马斯亮蓝法进行定量，调节蛋白浓度，取40 μl蛋白经SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，封闭后加入稀释后的一抗、二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔单克隆IgG)，进行抗原抗体反应。用DAB溶液检测杂交信号，结果用Gel Doc2000凝胶成像系统测定各条带积分灰度值，所得结果为扣除背景的积分光密度(OD)，以β-actin作为内参，计算相对值。

1.4 统计学分析 所有数据采用SPSS10.0统计软件进行分析，测定数据以±s表示，采用t检验及单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 干预12 w后，SHR对照组的大鼠死亡1只，SHR药物治疗组与SHR对照组比较，收缩压(SBP)明显降低，有显著差异性，但仍高于WKY对照组;三组心率无显著性差异。见表1。

2.2 免疫组化结果 干预12 w后与WKY对照组大鼠肾脏胶原Ⅳ免疫组化表达(n=10，5.12±1.11)比较，SHR对照组肾脏组织胶原Ⅳ含量明显增高(n=9，13.21±3.5，P＜0.01)，药物干预组能显著降低胶原Ⅳ表达(n=10，6.66±1.06，P＜0.01)。见图1。

表1 干预12 w后各组大鼠收缩压、心率比较(±s)

表1 干预12 w后各组大鼠收缩压、心率比较(±s)

与WKY对照组比较:1)P＜0.01，与SHR对照组比较:2)P＜0.01

组别 n 收缩压(mmHg) 心率(次/min)WKY对照组10 130.00±31.33 378.37±39.00 SHR对照组 9 222.66±21.581) 391.22±29.11干预组 10 160.60±18.292)369.53±30.00

图1 各组肾脏胶原Ⅳ免疫组化表达(DAB，×200)

图2 各组MMP-9、c-fos mRNA表达

2.3 实时荧光定量RT-PCR结果 SHR对照组MMP-9、c-fos mRNA表达明显高于WKY对照组(P＜0.01)，药物干预组能显著降低MMP-9、c-fos mRNA表达水平(P＜0.01)。见图2。

2.4 Western印迹结果 SHR组MMP-9、c-fos蛋白表达显著高于WKY对照组(P＜0.01)，药物干预组均能够降低MMP-9、c-fos蛋白表达水平(P＜0.01)。见图3。

图3 各组MMP-9、c-fos蛋白表达

3 讨论

肾脏对高血压引起的血流动力学刺激发生适应性代偿反应，可以导致病理性肾脏重构。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在高血压器官重构的发病机制中发挥了重要作用〔1〕。ARB阻断RAAS的受体水平，理论上能够有效阻断AngⅡ对AT1受体的作用，发挥心血管保护作用。此外，ARB可以有效改善单纯应用ACEI所导致的组织醛固酮逃逸现象〔2〕。本实验中，与WKY对照组比较，药物干预组SBP明显下降。SHR对照组血浆AngⅡ明显增高，药物干预组AngⅡ明显降低。提示ARB能够有效抑制RAAS系统。

本实验中，与WKY对照组比较，SHR对照组及药物干预组肾脏组织Ⅳ型胶原表达明显增高，药物干预组能够降低胶原表达提示:Ⅳ型胶原增生在高血压肾脏中发挥重要作用，而阻断RAAS系统能有效降低其表达。

基质金属蛋白酶(MMPs)能够特异地降解细胞外基质，在器官组织重构中起重要的作用。有研究显示，在高血压肾脏病中的的MMP-9表达和活性增高〔3，4〕。这说明MMP-9在肾脏重构过程对细胞外基质的合成、分解产生重要的影响。此外，研究同样发现，c-fos在在高血压肾脏病肾脏重构过程也发挥重要作用〔5〕。本研究通过对老龄高血压大鼠研究发现，SHR肾脏中MMP-9的表达较同龄WKY明显增多，在SHR，RAAS过度激活，以及c-fos等生长因子促进肾脏Ⅳ型胶原等细胞外基质的合成，但MMP-9的过表达说明，MMP-9增强部分肾脏Ⅳ型胶原等细胞外基质的分解代谢，均提示MMP-9在肾脏重构过程中发挥作用。此外，与WKY对照组比较，SHR各组c-fos明显增高，提示AngⅡ结合AT1受体，通过信号转导系统进一步促进与基因转录调控相关的c-fos等因子的表达，促进细胞的增生和肥大。本实验结果:老龄SHR组MMP-9及c-fos mRNA和蛋白表达明显高于WKY对照组，药物干预组能够显著降低其表达水平，此外，药物干预组显著降低肾脏Ⅳ型胶原的表达水平，说明ARB类药物能够阻断RAAS系统部分通过抑制MMP-9及c-fos途径改善肾脏重构，发挥保护性作用。

综上，本研究结果进一步提示，应用ARB可以有效保护靶器官，预防和逆转器官重构。

1 孙宁玲，王鸿懿，陈源源，等.ERK表达及活化在自发性高血压大鼠心肌肥厚中作用的研究〔J〕.高血压杂志，2002;10(3):352-5.

2 李淑梅.血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体1拮抗剂对组织醛固酮逃逸现象的实验研究〔J〕.中华心血管病杂志，2001;29(5):549-52.

3 Nicoletti A，Heudes D，Hinglais N，et al.Lelf ventricular fibrosis in renovascular hypertensive rats〔J〕.Hypertension，1995;26(1):101-11.

4 苗 伟，高 枫，龚少愚，等.原发性高血压患者血清基质金属蛋白酶9与升主动脉弹性的关系〔J〕.中华高血压杂志，2010;4(3):385-9.

5 院红梅，潘敬远.双肾双夹肾性高血压大鼠左心室原癌基因c-fos表达的变化〔J〕.广州医学院学报，2002;30(1):62-3.