人参皂苷-Rg3对兔耳增生性瘢痕中Bcl-2、Bax表达的影响

刘鹤松 张可佳 吴 杰 赵自然 (吉林大学第一医院皮肤性病科，吉林 长春 300)

细胞凋亡在病理性瘢痕(PS)形成中起着重要的作用。人参皂苷-Rg3(GS-Rg3)是从人参中分离提纯的一种单体，为四环三萜类人参二醇型皂苷〔1〕。大量研究表明GS-Rg3能促进肿瘤细胞凋亡，并抑制其转移。Bc1-2是一种凋亡抑制基因，其编码蛋白能抑制细胞发生凋亡，并能在生长因子缺乏时延长细胞存活时间，甚至使细胞“永生化”〔2〕。Bax是在人前白细胞基因文库中发现的一种凋亡相关基因，基本生物学特性是促进细胞凋亡，这一作用受Bcl-2的调节〔3〕。本实验拟研究人参皂苷-Rg3对兔耳增生性瘢痕中Bcl-2、Bax蛋白质的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 大耳白兔24只，雌雄不拘，体重(2.5±0.2)kg，吉林大学实验动物中心提供。根据时间分为2 w、4 w、6 w 及对照组。

1.2 主要仪器及试剂 主要仪器:高精度轮转式石蜡切片机购自日本的LAICA。电热恒温干燥箱购自中国上海实验仪器总厂。石蜡包埋机、恒温孵化箱购自日本的SANYO。显微镜购自日本的OLYMPUS。CO2孵箱购自美国SHEL LAB;酶标仪购自美国BIO-RAD。免疫组化试剂盒、DAB显示试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。主要试剂:GS-Rg3来自吉林大学基础医学院。柠檬酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH 6.0)、0.01 mol/L(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)为吉林大学白求恩医学院配制。

1.3 动物模型的制备 用速眠新注射液0.2～0.3 ml/kg，肌肉注射。麻醉生效后，强力消毒碘消毒兔耳腹面皮肤，切除2 cm×2 cm的全层皮肤，每耳4～6处，创可贴包扎创面。将动物编号，分笼饲养。3 w后创面形成凸起的增生性瘢痕组织。于四组动物耳部增生性瘢痕组织处行局部封闭注射，实验组注射GS-Rg3(浓度6 mg/2 ml)，对照组注射等体积的0.9%生理盐水，每3 d一次。分别于用药后2 w、4 w、6 w切取瘢痕组织，经4%多聚甲醛固定48～72 h，石蜡包埋切片。

1.4 实验方法 所取瘢痕组织立刻经4%多聚甲醛-0.01 mol/L PBS(pH7.4)固定。6 h后，PBS漂洗4～5 h，每小时交换洗液，或4℃冰箱过夜。经乙醇常规脱水，二甲苯透明后。浸蜡、包埋。用石蜡切片机连续切片，每片标本4 μm厚，HE染色、免疫组化法中的链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)染色。PBS阴性对照。

1.5 结果判定 免疫组化染色阳性结果为棕黄色或棕黑色颗粒。每例切片随机选择5个高倍视野，计数每个视野中100个细胞中的阳性细胞数，计算5个视野的平均阳性率。

2 结果

2.1 兔耳增生性瘢痕大体观察 兔耳腹侧创面1 w左右上皮化，局部逐渐突起，圆形、淡红色、质硬。上皮化后3 w左右，增生厚度为兔耳腹侧皮肤全层厚度的3～4倍。随着给药时间的延长，60 d左右瘢痕开始逐渐软化，体积缩小，逐渐趋于平复。而对照组继续处于增生状态。

2.2 GS-Rg3对兔耳增生性瘢痕中Bcl-2、Bax表达的影响GS-Rg3可明显降低Bcl-2的表达水平，用药后2 w开始表达量逐渐下降，6 w明显减少;而对照组有较多量的Bcl-2表达。GSRg3可明显增加Bax的表达，用药后2 w开始表达量明显增加，而对照组则有少量表达。见图1、表1。Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Ced-9 等。这些家族的成员可形成同源或异源二聚体，调节细胞的死亡和存活。Bax是在人前白细胞基因文库中发现的一种凋亡相关基因，定位表达于胞质内，在部分组织中与Bcl-2同时表达，并且Bax也不是总表达于细胞凋亡率高的组织。Bax的基本生物学特性是促进细胞凋亡，这一作用受 Bcl-2、Bcl-xl、Bad 调节。

表1 增生性瘢痕用药前后Bcl-2、Bax表达比较(%，，n=24)

表1 增生性瘢痕用药前后Bcl-2、Bax表达比较(%，，n=24)

与用药前比较:1)P＜0.01

56.92±10.56 8.37±1.29用药后2 w 27.98±7.311) 12.01±1.711)用药后4 w 20.25±5.761) 16.89±2.331)用药后6 w 14.89±3.111) 24.32±3.741)Bcl-2 Bax用药前时间

图1 增生性瘢痕Bcl-2、Bax阳性表达(免疫组化SP法，×40)

本实验采用免疫组化技术，分别对兔耳增生性瘢痕中用药前后Bcl-2蛋白质的表达进行了研究。结果显示:GS-Rg3组Bcl-2蛋白质在用药后2 w开始表达量逐渐下降，6 w明显减少;而对照组有较多量的Bcl-2表达。为了评价Bax在增生性瘢痕中的作用，本文利用免疫组化方法检测了Bax蛋白质，结果显示:用药后2 w开始表达量明显增加，而对照组则有少量表达，表明GS-Rg3可导致Bax蛋白质表达增加，这也进一步证实了Bcl-2蛋白质表达降低和Bax蛋白质表达增加是导致成纤维细胞凋亡的关键。这与以往的研究结果一致，说明Bcl-2家族在增生性瘢痕形成和消退过程中起到非常关键的作用。

Bcl-2基因及蛋白质的表达可阻止细胞的凋亡，而Bax基因表达则有促进和诱导细胞凋亡的作用，Bcl-2与Bax可自身形成二聚体，也可相互作用成为二聚体。Bcl-2/Bax的比率高低也决定细胞处于凋亡或存活。在Bax缺少的情况下，Bcl-2的过量表达能阻止细胞凋亡。因此Bax和Bcl-2之间既存在竞争又能独立地调控细胞凋亡〔7〕。Bax能在较为广泛的pH范围内形成离子通道，允许一些离子和小分子如细胞色素C等穿过细胞膜进入细胞质，从而引起细胞凋亡〔8〕。Bcl-2基因表达异常增加可使已有基因异常改变的成纤维细胞逃避凋亡，由此引起的基因异常事件的积累是导致瘢痕形成的必要前提。增生性瘢痕是组织损伤后修复过度的一种改变，表现为成纤维细胞的大量增生以及胶原等间质蛋白的沉积。Ladin等〔9〕发现，瘢痕疙瘩和培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中Bcl-2蛋白表达升高，并伴有细胞凋亡率降低。Bcl-2调控机制至今尚不明了，但有几种理论已被广泛承认:①Bcl-2蛋白作为一种抗氧化剂，控制线粒体膜的膜电位从而调节细胞的凋亡。②Bcl-2与Bax结合形成杂合二聚体，抑制Bax的促凋亡作用。③Bcl-2降低线粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性，从而使细胞免于凋亡。④Bcl-2影响细胞内Ca2+重新分布，而Ca2+激活核酸内切酶。⑤通过蛋白激活放大，使得细胞骨架及其他小分子化合物发生改变。本文认为通过与Bax结合成杂合二聚体，可抑制Bax的促凋亡作用。是否同时存在其他调控机制有待深入研究。

3 讨论

瘢痕增生一直是创伤修复领域的研究热点。目前实验研究主要从成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制，胶原的合成与降解失衡，大量细胞因子的产生以及三者的相互关系方面探求产生瘢痕的形成机制。大量研究表明人参皂苷Rg3作为中药抗肿瘤药物具有促进肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤生长、抗肿瘤细胞黏附、侵袭和转移、抑制肿瘤新生血管形成等作用〔4〕。

Bcl-2家族是一类基因结构相似、参与细胞凋亡调节的基因，在各种损伤及瘢痕形成过程中起非常重要的作用〔5，6〕。Bcl-2家族成员分为两类，一类是能促进细胞凋亡的基因，成员有 Bax、Bad、Bid、Bik、Mcl-l和 Al;另一类能抑制细胞凋亡，包括

1 王本祥.人参研究进展〔M〕.天津科学技术出版社，1991:97-9，125-53.

2 Wong W，Gruber J.Viral interactions with the p53 gene in human cancer，NCI workshop〔J〕.J Natl cancer Inst，1994;86:177.

3 Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homology，Bax，that accelerates programmed cell death〔J〕.Cell，1993;74:609-19.

4 梁 宇，崔 凝，袁忠海.人参皂苷Rg3抗肿瘤作用的研究进展〔J〕.中国现代药物应用，2007;1(11):105.

5 King ED，Matteson J，Jacobs SC，et al.Incidence of apoptosis，cell pro-liferation and Bel-2 expression in transitional cell carcinoma of the bladder association with tumor progression〔J〕.J Urol，2000;201:315-8.

6 Krajewski S，Krajewska M，Shabaik A，et al.Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax，a dominant inhibitor of Bcl-2〔J〕.Am J Pathol，2000;211:215-8.

7 红 斌，翟琦巍，郑仲承.Bcl-2基因的转录调控〔J〕.生物化学与生物物理学报，2000;32(2):95-9.

8 袁海波，沈忠明.细胞凋亡的分子机理〔J〕.上海大学学报，2001;7(1):77-80.

9 Ladin DA，Hou Z，Patel D，et al.The use of athymic nude mice for the study of human keloids〔J〕.Wound Rep Reg，1998;6:2837.