灰树花多糖诱导HeLa细胞凋亡的体外实验

范晓艳 刘 娜 金岳雷 朱金玲 吕冬霞 (佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 54007)

化疗是宫颈癌较为传统的治疗方法，传统的化疗药物有不同程度的毒副作用，长期应用后其毒副作用给患者带来极大的痛苦甚至危及生命〔1～3〕。寻找毒性小、药物不良反应少且有一定疗效的药物治疗肿瘤成为肿瘤治疗的途径之一。研究表明，灰树花多糖(Polysaccharide of grifola frondosa，PGF)具有稳定血压、降低血糖、改善脂肪代谢、增强免疫功能、抑制肿瘤、抗HIV病毒等生理活性〔4〕。本实验探讨PGF对HeLa细胞凋亡的影响，为抗肿瘤天然药物的开发和利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌HeLa细胞购于武汉大学典型培养物冷藏中心。净化工作台(苏州净化设备厂)，二氧化碳培养箱(美国)，倒置相差显微镜(日本)，酶标仪(LABSYSTEMS)，小牛血清、RPMI-1640培养液(杭州四季青)，二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)(上海普飞生物技术有限公司)，PGF粉末(浙江方格药业有限公司)，顺铂粉剂(山东齐鲁制药厂)，半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养和传代 配制含10%灭活小牛血清的RPMI-1640完全培养液。将宫颈癌HeLa细胞按1×105个/ml的浓度分别接种在含完全培养液的培养瓶内，5%CO2，37℃饱和湿度培养箱内培养。2～3 d传代一次，所有实验均在细胞处于对数生长期进行。

1.2.2 药物配制 供试药物均用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液配制。PGF设 3个浓度:0.01、0.05、0.10 mg/L。顺铂:1 mg/L。

1.2.3 MTT法检测细胞抑制率 将对数生长期的HeLa细胞按1×104个/ml的密度移入96孔培养板，每孔加入200 μl细胞悬液，37℃、5%CO2的培养箱中培养。24 h后，弃去原培养液，每孔加入不同浓度的 PGF溶液200 μl，其终浓度分别为0.01、0.05、0.10 mg/L;空白对照组中仅加10%小牛血清的RPMI-1640培养液。

每个浓度设立8个复孔，把培养板移入培养箱中继续培养12、24、48 h。经过 12、24、48 h 后分别加入 MTT(5 mg/L)20 μl，继续培养4 h，吸弃孔内培养上清液，每孔再加入 150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上，选择490 nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度值(OD)。实验重复3次。

细胞抑制率=(1－实验组OD值/对照组OD值)×100%

1.2.4 苏木素-伊红(HE)染色法观察凋亡细胞形态 将用多聚赖氨酸处理的盖玻片置于6孔板中，按1×105个/ml浓度接种细胞，培养24 h后，加入不同浓度的PGF溶液，分别于12、24、48 h进行常规HE染色。在显微成像系统下观察结果。

1.2.5 免疫组化方法检测caspase-3蛋白的表达 免疫组化用常规链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法，具体操作按说明书进行。镜下观察细胞膜和细胞质出现棕黄色或褐色为caspase-3表达阳性细胞。显微镜下每个区域选取不重复的随机10个高倍视野(×400)，计算caspase-3阳性细胞数，求平均值。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件进行处理，实验数据以表示，参数统计采用t检验。

2 结果

2.1 PGF对HeLa细胞的体外抑制率 MTT结果显示，PGF对Hela细胞的增殖抑制作用均有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。见表1。

表1 PGF对Hela细胞的抑制率(%，，n=8)

表1 PGF对Hela细胞的抑制率(%，，n=8)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

剂量(mg/L)抑制率对照组12 h OD值 抑制率24 h OD值 抑制率48 h OD值1.056±0.098 － 1.016±0.054 － 0.932±0.039 －0.01 0.973±0.056 7.86 0.889±0.0281)12.50 0.756±0.0371)18.88 0.05 0.881±0.0221)16.57 0.768±0.0322)24.41 0.654±0.0512)29.83 0.10 0.711±0.0682)32.67 0.623±0.0502)38.68 0.512±0.0482)45.06

2.2 PGF对Hela细胞形态的影响 倒置显微镜下观察HE染色细胞，与对照组比较，PGF处理组可见典型的细胞体积缩小、变圆皱缩，细胞核深染，染色质浓缩和断裂。

2.3 免疫组化法检测caspase-3的表达 PGF促进Hela细胞的caspase-3高表达，其作用呈一定的浓度和时间依赖性。见表2。

表2 PGF对Hela细胞caspase-3表达的影响(%，)

表2 PGF对Hela细胞caspase-3表达的影响(%，)

9.33±1.52 10.11±1.67 10.46±1.50 0.01 mg/L 12.90±2.711) 12.58±1.451) 14.76±1.841)0.05 mg/L 24.76±1.972) 33.61±3.352) 38.65±3.132)0.10 mg/L 37.16±2.932) 38.93±3.622) 49.85±3.312)12 h 24 h 48 h对照组组别

3 讨论

本实验利用MTT法观察 PGF作用于 HeLa细胞12、24、48 h后的抑制率，结果表明，PGF对HeLa细胞具有一定抑制作用，其抑制率呈现时间和剂量依赖性。HE染色观察到典型的凋亡细胞。caspase-3是caspase家族中的成员，位于细胞凋亡caspase级联反应的下游，通过下游效应因子切断细胞间的信号传递，诱导形成凋亡小体，执行凋亡功能〔5〕。本实验运用免疫组化法检测了PGF作用12、24、48 h后HeLa细胞的caspase-3蛋白的表达，结果显示，PGF促进Hela细胞的caspase-3高表达，其作用呈一定的浓度和时间依赖性，表明PGF诱导肿瘤细胞凋亡与促进caspase-3高表达有关。

大量实验证实，许多真菌多糖如香菇多糖、云芝多糖等具有抗肿瘤作用，有研究显示PGF对S180肉瘤的生长具有抑制作用〔6〕。本研究进一步证实了PGF在体外能诱导肿瘤细胞凋亡作用，其作用机制可能与caspase-3高表达有关。

1 Leyvraz S，Ohnuma T，Lassus M，et al.Phase I study of carboplatin in patients with advanced cancer intermittent intravenous bolus，and 24-hour infusion〔J〕.J Clin Oncol，1985;3(10):1385-92.

2 Maines MD，Mayer RD.Inhibition of testicular cytochrome P-450-dependent steroid biosynthesis by cis-platinum.Reversal by human chorionic gonadotropin〔J〕.J Biol Chem，1985;260(10):6063-8.

3 Gandara DR，DeGregorio MW，Wold H，et al.High-dose cisplatin in hypertonic saline:reduced toxicity of a modified dose schedule and correlation with plasma pharmacokinetics.A Northern California Oncology Group Pilot Study in non-small-cell lung cancer〔J〕.J Clin Oncol，1986;4(12):1787-93.

4 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev，2001;6(1):48-60.

5 Nicholson DW，Thornberry NA.Caspases:killer proteases〔J〕.Trends Biochem Sci，1997;22(8):299-306.

6 杜景卫，夏作理，李清初，等.灰树花多糖抗S180肉瘤的实验研究〔J〕.泰山医学院学报，2005;26(2):95-8.