塞来昔布对宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响及作用机制

董文辉 吕玉人 刘永茂 (民航总医院妇产科，北京 00025)

环氧合酶(COX)是花生四烯酸代谢过程中前列腺素(PGS)合成的限速酶〔1〕，有 COX-1 和 COX-2 两种同工酶〔2〕。近年研究发现宫颈癌细胞中COX-2表达。塞来昔布(celecoxib)是第一个高效的COX-2特异性抑制剂〔3〕，对肿瘤的发生、发展和转移均有抑制作用。本研究旨在观察塞来昔布对人宫颈癌Hela细胞株增殖和凋亡的影响，并进一步探讨塞来昔布影响宫颈癌细胞增殖和凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及材料 人宫颈癌Hela细胞购自中科院上海细胞所，塞来昔布购自美国辉瑞公司(BK10CCEE069)，四甲基耦氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，RPMI-1640购自美国Hyclone公司。

1.2 仪器 37℃恒温空气摇床(上海医疗器械厂)，低温高速离心机(德国宝丽曼公司)，80I荧光显微镜(日本尼康公司)，-80℃冰箱(日本三洋公司)，LD-5台式离心机(北京六一仪器厂)，SM-510高压灭菌锅(美国YAMATO公司)，电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)，pH计(上海精密仪器公司)，磁力搅拌器(上海精密仪器公司)，SW-CJ-1 FD超净工作台(深圳市铭科化工有限公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，MCO-175型CO2孵箱(日本三洋公司)，BCD-2398TC冰箱(青岛海尔股份有限公司)，75 cm2细胞培养瓶斜口、24孔板，Nunclon细胞培养板(丹麦Nunc公司)。

1.3 方法

1.3.1 塞来昔布配制 取胶囊1粒(含塞来昔布200 mg)，加入20 ml含少量DMSO的生理盐水充分搅拌成混悬液，现用现配。0.22 μm滤膜除菌，再用 RPMI-1640培养液稀释80倍(320 μmol/L)备用。

1.3.2 细胞培养 人宫颈癌Hela细胞接种于细胞培养瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液置于5%CO2的37℃培养箱中培养，待其贴壁生长至70% ～80%时用0.25%胰蛋白酶消化传代，2～3 d传代1次。

1.3.3 Hela细胞塞来昔布体外诱导 将处于指数生长期的Hela细胞，用含10%新生牛血清的 IMDM制成5×104个细胞/L细胞悬液，每孔100 μl接种于96孔板孔内。培养24 h后，换成含3%新生牛血清的维持培养液100 μl/每孔。接种3块板(24、48、72 h时间点各1块)。实验组分别加入100 μl终浓度为20、40、80、160 μmol/L 的塞来昔布，每浓度重复6 孔，同时设单细胞悬液不加药物的正常对照及无细胞培养液的空白对照，于5%CO2的37℃培养箱中分别培养24、48、72 h。

1.3.4 细胞抑制率测定 在每个不同时间点，取对应的细胞培养板进行测定。首先于每孔中加入新鲜配制的MTT液20 μl，继续培养4 h;然后吸去孔内上清液，每孔加入 DMSO 150 μl振荡至结晶物充分溶解后，在全自动酶标仪上570 nm处检测吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率。

2 结果

随药物浓度的增加、作用时间的延长塞来昔布对Hela细胞的增殖抑制效应，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，并呈现时间和浓度的依赖性。

当浓度为80 μmol/L塞来昔布作用Hela细胞48 h后，对Hela细胞的增殖起到明显的抑制作用，其OD值0.732±1.83，抑制率为30.76%;作用72 h后OD值为0.421±1.89，抑制率为61.90%。因此本文选择80 μmol/L的塞来昔布作为实验用量。

表1 塞来昔布对Hela细胞增殖抑制效应的影响(±s)

表1 塞来昔布对Hela细胞增殖抑制效应的影响(±s)

与对照组比较:1)P＜0.01

组别 24 h OD IR(%)48 h OD IR(%)72 h OD IR(%)20 μmol/L 1.125±1.031) 2.933±1.43 0.987±2.21 10.17±1.561) 0.813±2.14 26.43±1.331)1.159±1.89 1.113±2.151 1.105±2.53 40 μmol/L 0.933±1.171) 14.31±1.56 0.868±1.87 19.78±1.691) 0.638±2.23 42.26±2.051)80 μmol/L 0.831±1.881) 28.31±3.37 0.732±1.831) 30.76±2.53 0.421±1.891) 61.90±1.761)160 μmol/L 0.89±1.781) 40.55±2.45 0.565±2.131) 49.24±2.851) 0.355±1.581) 67.87±2.331)对照组

3 讨论

文献报道，在COX-2与宫颈癌的研究中，目前主要的相关结论有:①与正常宫颈组织相比，宫颈癌组织中COX-2表达阳性率增高，腺癌较鳞癌更高 (80.7%和40.6%)，精液可上调宫颈癌Hela细胞系COX-2的表达，并诱导PGE2受体表达。②宫颈腺癌中COX-2可促进肿瘤血管生成和肿瘤增殖，与肿瘤进展相关。③宫颈癌COX-2的表达与淋巴结转移和宫旁转移有相关性。④检测COX-2在宫颈癌肿瘤组织/间质表达强度之比，可用于预测放化疗的敏感性，比值越高，患者反应越差，3 年无病生存率越低〔4，5〕。

COX-2抑制剂发挥抗癌作用的机制有:①抑制肿瘤细胞生长的同时，对正常细胞的影响较少。②抑制肿瘤血管生成，降低肿瘤细胞转移能力。COX-2抑制剂可抑制VEGF的合成，降低肿瘤微血管密度，以剂量和时间依赖关系抑制肿瘤的侵袭和转移。③增强肿瘤细胞对放疗和化疗的反应性。Sorensen等的研究发现，低浓度的塞来昔布能明显增强博来霉素、顺铂、长春新碱的细胞毒作用。④增强肿瘤免疫治疗的效果。⑤可逆转肿瘤引起的消瘦和高钙血症〔6～10〕。

本实验结果提示塞来昔布促进细胞凋亡的作用可能大于抑制细胞增殖的作用，为塞来昔布应用于宫颈癌的辅助治疗提供了实验依据。

许多针对宫颈癌的细胞毒性化疗药物对人体正常组织有毒性作用，致使很多患者难以耐受，因而不能有效抑制宫颈癌的生长。而在本研究中，选择性COX-2抑制剂能在体外有效抑制宫颈癌细胞的生长，选择性越高，抑制作用越强塞来昔布不抑制人胃黏膜前列腺素的产生，消化性溃疡的发生率较传统非甾体抗炎药降低50%。其对宫颈癌生长的高效抑制和低副反应，提示可能成为治疗宫颈癌的有效药物，其临床疗效尚有待进一步验证。

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