肾性高血压大鼠脑ATP酶活性和血管紧张素Ⅱ水平及厄贝沙坦的干预

2011-08-02吴泽兵商黔惠姜黔峰

中国老年学杂志 2011年18期

吴泽兵商黔惠姜黔峰吴芹袁萍

(遵义医学院临床医学研究所遵义医学院附属医院心血管内科，贵州遵义 563003)

高血压发病的细胞膜离子转运缺陷机制是当今研究的热点〔1～3〕;细胞膜钠泵(Na+，K+-ATPase)、钙泵(Ca2+-ATPase)活性减低，是导致高血压靶器官损害的关键环节。Kent等〔4〕研究发现高血压大鼠下丘脑、脑干、皮质等组织中Na+，K+-ATP酶活性没变化，但α3亚基表达增加。研究发现，大脑局部缺血激活局部RAS，升高局部 AngⅡ水平〔5〕，血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)拮抗剂厄贝沙坦能有效阻断AngⅡ的作用，降低血压，保护靶器官损害〔2，6，7〕，但有关厄贝沙坦对脑 ATP 酶的影响鲜有报道。本实验旨在研究厄贝沙坦对二肾一夹(2K1C)肾血管性高血压大鼠(RHR)脑ATP酶活性及AngⅡ的影响，了解高血压时ATP酶与AngⅡ之间的相互关系，探讨突然停用降压药后血压反跳的可能机制，为逆转高血压脑损害提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 10周龄健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(四川省医学科学院实验动物研究所)，清洁级，体重180～220 g，共40只，合格证号:SCXK(m)2004-16，饲养1 w以适应环境。

1.2 主要试剂厄贝沙坦由扬子江制药股份有限公司惠赠;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、ATP酶测试盒购于南京建成生物工程研究所;AngⅡ试剂盒购于北京北方生物技术研究所。

1.3 主要仪器 BESN-II多通道动物无创测压仪:南京德塞生物公司;721-16C14型分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;GC-2010γ放射免疫计数器:科大创新股份有限公司中佳分公司。

1.4 模型制备〔8〕与分组戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，在左肾动脉放置内径为0.25 mm的银夹。测量术前、术后及用药后血压，无创尾动脉测压仪测定清醒大鼠尾动脉压，术后4 w收缩压≥140 mmHg者确定已形成稳定高血压，即为两肾一夹RHR制模成功，入选RHR组。在术后8 w血压上升稳定，将模型制备成功的18只RHR，随机分为模型组、厄贝沙坦组、停药组，每组6只，分笼饲养。另设假手术组6只，分离左肾动脉，但不安置银夹。

1.5 给药方法术后第九周开始灌胃，其中厄贝沙坦组给予厄贝沙坦50 mg/kg，1次/d灌胃，连续8 w。停药组在给予厄贝沙坦灌胃，7 w后停药7 d;模型组和假手术组均以等量蒸馏水灌胃8 w。

1.6 观察指标

1.6.1 血压的测量采用BESN-II多通道动物无创测压仪，在大鼠清醒状态下间接检测尾动脉收缩压，连续测量3次，取平均值。

1.6.2 大脑皮质和海马ATP酶活性检测实验前大鼠禁食12 h，腹腔注射麻醉，断头处死大鼠，摘取大鼠大脑，分离大脑皮质和海马，以上组织用4℃生理盐水漂洗2～3次后，滤纸吸干水分后称重，－70℃冰箱保存。从冰箱中取出脑，按W/V 1∶10加入预冷生理盐水(4℃)，在匀浆管中恒速匀浆，制成10%组织匀浆，将匀浆液倒入离心管中，4℃ 1 500 r/min离心10 min，取上清液0.2 ml加0.8 ml生理盐水稀释成2%的匀浆待测〔9〕。用考马斯亮蓝法检测匀浆蛋白的浓度，用酶学比色法检测 Na+，K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性。

1.6.3 大脑皮质和海马AngⅡ检测按照温绍君法〔10〕组织匀浆，取上清液，用放射免疫法检测AngⅡ含量。

1.7 统计学分析采用SPSS11.0统计软件，数据以±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用完全随机设计方差分析和LSD-t检验。对相关变量采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 厄贝沙坦对RHR血压的影响肾性高血压大鼠血压〔(189±15)mmHg〕明显高于假手术组〔(134 ±9)mmHg〕(P＜0.01);厄贝沙坦治疗8 w后，血压明显下降〔(123±7)mmHg〕(P＜0.01);停用厄贝沙坦 7 d，血压明显上升〔(154 ±10)mmHg〕(P ＜0.01)。

2.2 厄贝沙坦对RHR脑ATP酶活性的影响 RHR大脑皮质和海马 Na+，K+-ATPase活性显著降低(P＜0.01，P＜0.05);厄贝沙坦治疗后及停药后，Na+，K+-ATPase活性无明显改变(P＞0.05)。RHR大脑皮质和海马Ca2+-ATPase活性显著降低(P＜0.01)，厄贝沙坦治疗后Ca2+-ATPase活性明显升高(P＜0.01)，停药后Ca2+-ATPase活性显著降低(均P＜0.01)。见表1、表2。

表1 厄贝沙坦对RHR大脑皮质ATP酶活性的影响(±s，n=6，μmolPi·h－1·mgpro－1)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01;与厄贝沙坦组比较:3)P＜0.01

组别 Na+，K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶4.764±0.502 4.213±0.525模型组 2.780±0.6011) 2.293±0.3611)厄贝沙坦组 3.031±0.7421) 3.768±0.7242)停药组 2.897±0.6931) 2.228±0.5831)3)假手术组

表2 厄贝沙坦对RHR大脑海马ATP酶活性的影响(±s，n=6，μmolPi·h－1·mgpro－1)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01;与厄贝沙坦组比较:3)P＜0.01

组别 Na+，K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶8.959±1.854 4.710±0.723模型组 4.632±0.5311) 2.685±0.4961)厄贝沙坦组 5.997±0.9771) 4.409±0.9882)停药组 5.146±0.8121) 2.789±0.6531)3)假手术组

2.3 厄贝沙坦对RHR血浆、大脑皮质、海马AngⅡ的影响RHR血浆AngⅡ显著升高(P＜0.01)，厄贝沙坦治疗后及停药后，AngⅡ进一步升高(P＜0.01);RHR大脑皮质、海马AngⅡ显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，厄贝沙坦治疗后大脑皮质、海马AngⅡ进一步升高;停药后，大脑皮质、海马AngⅡ显著降低(P＜0.01)。见表3。

表3 厄贝沙坦对RHR血浆、大脑皮质、海马AngⅡ的影响(±s，n=6)

与假手术组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.01;与厄贝沙坦组比较:4)P＜0.01

组别血浆(pg/ml) 大脑皮质(pg/g) 海马(pg/g)403.772±96.311 22.387±3.489 66.186±11.890模型组 912.275±137.8892) 58.211±9.4452) 95.008±14.5951)厄贝沙坦组1 288.140±82.1242)3)84.934±22.9422)3) 153.323±39.6202)3)停药组 1 134.713±172.1732)3)54.217±10.5572)4) 98.878±14.3781)4)假手术组

2.4 RHR脑ATP酶活性与AngⅡ变化的相关分析直线相关分析发现，RHR模型组大脑皮质Ca2+-ATPase与大脑皮质局部AngⅡ变化呈显著负相关(r=－0.900，P＜0.05)，海马Ca2+-ATPase与海马局部 AngⅡ变化呈显著负相关(r=－0.831，P ＜0.05)。

3 讨论

在中国，高血压的发生率高达18%，脑卒中是高血压最重要的并发症之一，因此，就脑卒中而言，防止其发生比治疗更重要。研究表明，慢性高血压主要影响各种高血压动物模型脑内小动脉，且不同脑区改变不同，在额叶皮质动脉壁增厚，管腔狭窄;海马动脉管腔狭窄，管壁面积无改变，表明已发生重塑。高血压微血管结构改变和血管网稀疏、消失，可导致灌注不足、大小不等的梗死，引起神经元损害。研究发现〔11〕，SHR与Wistar-Kyoto(WKY)大鼠比，SHR脑室体积增大2倍，全脑体积和灰质、白质区厚度减少，提示SHR存在明显脑结构和代谢异常。Sabbatini〔12〕等研究发现，SHR海马体积减少，神经元丢失明显。提示SHR海马可能存在神经元变性改变。但关于SHR海马及皮质神经元损害的机制尚不清楚。

腺苷三磷酸酶在细胞膜兴奋性传导、神经递质的释放等方面发挥着重要作用，其活性被认为是神经细胞膜功能状态的标记〔13〕。脑细胞膜腺苷三磷酸酶活性下降，细胞内Na+、Ca2+增高，引起细胞毒性脑水肿和钙超载;钙超载可通过干扰线粒体氧化磷酸化使ATP生成减少，导致腺苷三磷酸酶活性进一步下降〔14〕，触发一系列病理反应，导致神经元不可逆性损伤。本研究结果显示，RHR脑皮质及海马Na+，K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性下降，局部AngⅡ升高，而且组织Ca2+-ATPase活性与局部AngⅡ呈显著负相关。提示在高血压时，大脑皮质及海马ATP酶活性降低，RAS系统激活，AngⅡ升高，细胞内钙超载，是高血压脑损害的机制之一。

研究发现大脑局部缺血24 h后不仅在缺血侧大脑皮层AT1R mRNA的表达升高，非缺血侧大脑皮层AT1R mRNA的表达也升高，提示脑缺血可能激活局部RAS，诱导AT1R的表达〔15〕。Blezer等〔16〕发现 AT1R拮抗剂氯沙坦能显著降低自发性脑卒中高血压大鼠(SHR-SP)脑卒中的发生率，延长大鼠的存活时间。本实验发现，厄贝沙坦治疗及停药后，肾性高血压大鼠大脑皮质、海马Na+，K+-ATPase活性均无明显改变。但厄贝沙坦治疗后Ca2+-ATPase活性显著恢复，提示钙超载缓解，血管痉挛解除，从而延缓脑损害;同时局部AngⅡ水平均明显升高，提示高血压时大脑局部缺血，厄贝沙坦通过血脑屏障，与中枢神经系统内升高的AT1R特异性结合，从而阻断AngⅡ的作用〔17，18〕。另一方面，增加的 AngⅡ与 AT2R 结合，激活激肽、NO系统，导致血管舒张，减轻靶器官缺血，从而起到脑保护作用〔16〕。厄贝沙坦停药后，Ca2+-ATPase活性明显降低，提示细胞膜Ca2+转运能力减弱;与此同时，AngⅡ虽然有降低趋势，但由于受体阻滞作用解除，AngⅡ与AT1R迅速结合，可能是停药后大脑局部细胞调节功能紊乱或脑损害的因素之一。

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