益气增敏方对2型糖尿病大鼠尿微量白蛋白及胰岛素抵抗的影响

薛红丽 张 曾 王文健 陈伟华 应 健 (复旦大学附属华山医院中医科,上海 200040)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症,也是慢性肾衰竭的主要原因之一,微量白蛋白尿是DN的早期表现。研究表明,除高血糖、高血压等因素参与了DN的发病过程外,胰岛素抵抗是DN发生发展的独立危险因素之一。因此,对DN的防治重点除严格控制血糖、血压外,尚需积极改善胰岛素抵抗。如何发挥中医药的临床特色,有效延缓DN的病情进展,是目前这一领域的研究热点之一。本课题组基于对胰岛素抵抗相关疾病中医“聚证”的认识,在临床上采用益气增敏方治疗早期DN取得了满意疗效。本研究旨在观察益气增敏方对2型糖尿病(T2DM)大鼠尿微量白蛋白(MAU)及胰岛素抵抗的影响,为进一步的临床运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择雄性SD大鼠40只,体重180～220 g(上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供)〔动物合格证号:SCKK(沪2008-0016)〕。饲养在室温(18～25)℃,相对湿度50%～80%的环境条件下,自由进食、饮水。

1.1.2 试剂与仪器 高脂饲料:18%猪油、8%蛋黄粉、2%胆固醇、0.2%胆盐和71.8%普通基础饲料(热量百分比),上海斯莱克实验动物有限公司制作。链脲佐菌素(STZ):Sigma S0130。葡萄糖测定:氧化酶法,试剂盒由北京普利莱基因技术有限公司提供。胰岛素测定:酶联免疫吸附法,试剂盒由Mercodia,Sweden提供。尿微量白蛋白测定:酶联免疫分析法,试剂盒由上海沪峰生物科技有限公司提供。血糖仪:罗康全活力型(ACCU-CHEK Active)血糖仪。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 选取健康SD雄性大鼠40只,体重180～220 g,适应性饲养1 w后,将大鼠随机分为2组:普通饲料组(NPD)10只和高脂饲料组(HFD)30只。2组大鼠自由进食、饮水4 w。4 w后,隔夜空腹12 h,高脂组30只大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素STZ(Sigma)35 mg/kg;普通饲料组10只大鼠腹腔注射相应容量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(p H4.4)。注射3 d后,尾尖采血测随机血糖,大于等于16.67 mmol/L者作为2型糖尿病造模成功大鼠。造模成功大鼠继续进食高脂饲料。

1.2.2 药品制备 益气增敏方由黄芪、绿豆衣、紫苏叶、黄柏、生蒲黄、黄连、泽泻等10位中药组成。将所有药物切碎混合,加8倍的水煎3次,分别2、1、1 h。后将药液浓缩成浸膏,得膏率为36.76%。该浸膏的制作由国家中药制药工程技术研究中心完成。浸膏4℃保存,双蒸水稀释至所需浓度使用。氯沙坦钾片(科素亚):杭州默沙东制药有限公司(批准文号:国药准字H20030654),研磨成粉状,灌胃前用双蒸水配成相应浓度溶液。

1.2.3 实验分组及给药方法 将造模成功的30只糖尿病大鼠随机分为3组,每组10只。2型糖尿病模型组(MOD,n=10),益气增敏方治疗组(YXZM,n=10)和氯沙坦治疗组(LOS,n=10)。普通饲料组作为对照组(CON,n=10)。对照组及模型组用相应容积双蒸水灌胃,益气增敏方治疗组用益气增敏方2.82 g(生药)/100 g(体重)灌胃,氯沙坦治疗组用氯沙坦20 mg/kg(体重)灌胃,每天1次,连续8 w。实验过程中除对照组动物予普通饲料外,余实验组动物均给予高脂饲料。

1.2.4 实验方法及指标测定

1.2.4.1 标本采集 毛细管眼底静脉丛采血,血液标本2 500 r/min 4℃离心10 min,分离血清测空腹血清血糖及胰岛素。

1.2.4.2 胰岛素抵抗指数(HOMA-IR) 内环境稳态模型法胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(IU/L)/22.5。

1.2.4.3 腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT) 在药物干预8 w后,每组取5只大鼠,隔夜禁食不禁水12 h,50%葡萄糖溶液(2 g/kg)腹腔注射,于注射前、注射后30、60、120 min时分别毛细管眼底静脉丛取血,测定血清葡萄糖浓度。

1.2.4.4 胰岛素耐量实验(ITT) 在药物干预8 w后,每组取5只大鼠,隔夜禁食不禁水 12 h,诺和灵 R(0.5 U/kg)腹腔注射,于注射前、注射后30、60、120 min时分别毛细管眼底静脉丛取血,测定血清葡萄糖浓度,ITT计算血糖下降相对值(与基础血糖的比值)。

2 结 果

2.1 益气增敏方对2型糖尿病大鼠体重、血糖及MAU的影响与CON组大鼠相比,MOD组大鼠体重下降,血糖、MAU明显升高。经益气增敏方治疗后,与MOD组大鼠相比,YQZM组大鼠体重无明显改变,血糖、MAU水平明显下降。经LOS治疗后,与MOD组大鼠相比,LOS组大鼠体重、血糖无明显改变,MAU水平明显下降。见表1。

表1 益气增敏方对2型糖尿病大鼠体重、血糖及MAU的影响(±s,n=10)

表1 益气增敏方对2型糖尿病大鼠体重、血糖及MAU的影响(±s,n=10)

与CON组相比:1)P＜0.05,2)P＜0.01;与 MOD组相比:3)P＜0.05,4)P＜0.01

分组 体重(g) GLU(mmol/L) MAU(μ g/24 h)CON 562.73 ±12.17 3.85±0.33 7.29±1.49 MOD 424.15±18.30 2)17.65±2.222) 51.50 ±6.542)YQZM 445.71±15.54 2)12.16±1.00 2)4)29.64±6.322)3)LOS 407.90±24.69 2)14.51±1.422)31.52±6.432)3)

2.2 益气增敏方对2型糖尿病大鼠HOMA-IR的影响 与CON组大鼠相比,MOD组大鼠HOMA-IR明显升高(16.59±2.65 vs 38.79±9.02,P＜0.01)。经益气增敏方治疗后,与MOD组相比,YQZM组大鼠HOMA-IR(22.68±2.37)明显降低(P＜0.05)。经氯沙坦治疗后,与MOD组大鼠相比,LOS组大鼠 HOMA-IR明显升高(51.43±6.27,P＜0.05)。

2.3 益气增敏方对2型糖尿病大鼠IPGTT及ITT的影响 药物干预8 w后,IPGTT实验显示,注射葡萄糖30、60、12 min时,模型组血糖与对照组相比显著升高(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01),表明模型组大鼠糖耐量异常。经益气增敏方治疗后,与模型组相比,各点血糖水平明显下降(P＜0.05),经氯沙坦治疗后,与模型组相比,各点血糖水平无明显下降。见图1。ITT实验显示,注射胰岛素30、60、12 min时,MOD组血糖下降程度与对照组相比显著降低(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),提示模型组大鼠胰岛素耐量异常。经益气增敏方治疗后,与模型组相比,30、60 min血糖下降程度明显升高(P＜0.01)。经氯沙坦治疗后,与模型组相比,各点血糖水平无明显下降。见图2。

图1 益气增敏方对2型糖尿病大鼠IPGTT的影响

图2 益气增敏方对2型糖尿病大鼠ITT的影响

3 讨 论

胰岛素抵抗在T2DM和DN的发病机制中占重要地位,MAU与胰岛素抵抗存在着密切的关系。研究发现,T2DM患者中胰岛素抵抗者较胰岛素敏感者MAU的发生率高。在T2DM患者中,MAU阳性者较MAU阴性者有更显著的胰岛素抵抗,而且胰岛素抵抗与尿白蛋白排泄率显著相关。有研究证实T2DM患者胰岛素敏感性与尿白蛋白排泄量呈负相关〔1～3〕。

T2DM是以胰岛素抵抗为基础,因胰岛素抵抗而不能正常进行葡萄糖代谢,除糖代谢紊乱外,常合并有脂代谢紊乱,类似于中医理论中的气化障碍。《素问》:“饮入于胃,游溢精气,上输于脾;脾气散精,上归于肺,通调水道,下输膀胱,水精四布,五经并行。”这是中医对饮食物进入体内后代谢转化过程的基本认识,其中以“游溢精气”和“脾气散精”最为关键,都属于气化作用。患者气化不足,精气不能游溢,脾气不能散精,物不化正,出现脂肪在腹部堆积,糖分、脂质在血液中积累。在气化障碍的基础上,邪热、湿浊、瘀血乘虚而入,糖代谢、脂代谢紊乱进一步加剧,发展形成DN等糖尿病慢性并发症〔4〕。

基于这一病机认识,我们临床使用益气散聚方用于防治T2DM早期肾病,取得了较好疗效。该方由黄芪、黄连、黄柏、生蒲黄、绿豆衣、紫苏叶、泽泻等10位中药组成。方中黄芪甘温补中,推动气化,助脾散聚布精;黄连、黄柏苦寒,清热、泻火、燥湿,祛湿热之邪。生蒲黄味甘性微寒,血分药而兼行气分,上者可清,下者可利,滞者可行。绿豆衣甘寒,解热毒。紫苏叶善行脾胃气滞,有行气宽中,和胃止呕之效。泽泻利水,渗湿,泄热。诸药合用,既有推动气化之功能,又能清热、解毒、行气、散瘀,使精微物质能够正常布散运化,脏腑功能得以恢复〔5〕。

本实验采用预先喂饲高脂饮食诱导胰岛素抵抗后,再联合低剂量的STZ部分破坏大鼠的胰岛细胞,诱导糖尿病大鼠模型。这种造模方法所诱导的伴胰岛素抵抗的大鼠糖尿病更近似于临床上的T2DM。本实验发现模型组大鼠尿微量白蛋白较对照组明显升高,表明该模型符合临床T2DM早期肾病的临床特征,这与我们既住的研究结果相一致〔6〕。微量白蛋白尿是DN的早期临床表现,这一阶段如采用适当的治疗尚可改善肾脏病变,减少尿蛋白的排出。本研究表明,益气增敏方可减少模型动物的MAU,改善胰岛素抵抗。氯沙坦亦可明显减少模型大鼠的MAU的作用,但对胰岛素抵抗无明显改善作用。

1 Abdul-Ghani M,Nawaf G,Nawaf F,et al.Increased prevalence of microvascular complications in type 2 diabetes patients with the metabolic syndrome〔J〕.Isr Med Assoc J,2006;8(6):424-5.

2 Aneliya I,Parvanov A,Roberto Trevisan,et al.Insulin Resistance and Microalbuminuria A Cross-Sectional,Case-Control Study of 158 patients with type 2 diabetes and different degrees of urinary albumin excretion〔J〕.Diabetes,2006;55(5):1456-62.

3 Hoehner CM.Association of the insulin resistance syndrome and microalbuminuria among nondiabetic native Americans〔J〕.J Am Soc Nephrol,2002;13(6):1626-34.

4 王文健 .聚证学说的建立和应用〔J〕.中西医结合学报,2007;5(2):111-4.

5 王文健.论聚证学说及临证辨治〔J〕.上海中医药杂志,2008;42(7):60-2.

6 李佑生,王文健,马宇滢,等.复方丹参滴丸防治大鼠早期糖尿病肾脏损害的研究〔J〕.中成药,2007;29(1):41-5.