依达拉奉对帕金森病小鼠黑质GSK-3 β表达的影响

周 波 文 敏 王文静 何宇红 余 彦 臧贵勇 焦 玲 张春林(贵阳医学院人体解剖学教研室,贵州 贵阳 550004)

目前尚缺乏帕金森病(PD)的特异性治疗方法,多年来一直以左旋多巴替代治疗为主,但远期疗效差,出现症状波动、异动症以及精神症状等并发症,不能延缓病程的发展和减少死亡率。因此发展长期有效的治疗方法,延缓病情进展,提高PD患者生活质量是目前亟待解决的问题。依达拉奉是一种广泛运用于缺血性脑卒中患者的氧自由基清除剂〔1〕,它可以通过抑制脂质过氧化〔2〕和调控凋亡相关基因的表达〔3〕抑制细胞死亡,发挥神经保护作用。本实验采用百草枯联合代森锰建立PD小鼠模型,通过检测黑质TH阳性神经元及糖原合成酶-3β(GSK-3β)的表达,探讨依达拉奉对PD的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 模型建立 健康雄性C57BL/6小鼠30只,7周龄,体重24～26 g,由重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司提供。小鼠饲养于贵阳医学院动物实验中心,室温维持在(18±2)℃,湿度维持在(50±10)%,12/12光暗周期,自由进食和饮水。实验开始前先给予适应环境1 w。小鼠随机分为正常对照组(10只)、模型组(10只)和依达拉奉治疗组。模型组给予百草枯(10 mg/kg,Sigma公司)和代森锰(30 mg/kg,Sigma公司),溶于生理盐水后腹腔注射,每周二、四早上各一次,连续6 w;依达拉奉治疗组在成功建模后给予依达拉奉注射液(商品名:必存,3 mg/kg,先声药业提供)腹腔注射,1次/d,连续2 w;对照组给予同等剂量的生理盐水。

1.2 敞箱实验 敞箱实验用于检测小鼠的自主运动活性。自制敞箱,长 ×宽 ×高为 80 cm ×80 cm ×40 cm,底部刻出16 cm×16 cm的格子25个。内壁涂黑。在安静、光线较暗的环境中检测。小鼠适应环境10 min后计数3 min内小鼠水平运动(移动的格子数)和垂直运动(双前肢离开地面站立的次数)。水平运动计分:动物穿过1格(三爪以上跨入)为1分,如果沿直线走每10 cm为1分;垂直运动计分:动物双足离开地面为标志,无论站立多长时间直至放下双足为1分。

1.3 标本采集 用3.6%的水合氯醛(1 ml/100 g体重)麻醉动物,在其左胸前壁纵行剪开心包,充分暴露心脏,经心包横窦引过一丝线,绕主动脉及肺动脉根部打一松结,剪开左心室,将套管插入升主动脉中,结扎固定套管并立即开始灌注。先用生理盐水50 ml(37℃)冲去血液,流速宜大,至右心室流出液体无色或略带红色,即可终止灌洗而改用固定液(4%多聚甲醛、饱和苦味酸、戊二醛)灌注,时间约30 min。灌注后开颅取脑,放入4%多聚甲醛固定24 h。经脱水、常规石蜡包埋、冠状连续切片,切片厚6 μ m,隔6取2,用于免疫组织化学染色。

1.4 TH和GSK-3β免疫组化(SABC法) ①石蜡切片常规脱蜡至水;②经新鲜配制3%H2O210 min灭活内源性酶;③用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液进行热抗原修复;④滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min。甩去多余液体,不洗;⑤滴加一抗湿盒中4℃过夜;⑥滴加生物素化山羊抗兔IgG,湿盒中37℃20 min;⑦滴加试剂SABC,湿盒中37℃20 min;⑧DAB显色,镜下控制反应时间;⑨脱水、透明和封片,显微镜下观察。各组切片均在相同时间、相同条件下完成免疫组织化学显色。对照组切片用0.1 mol/L PBS取代一抗,其余步骤同实验组。结果判定:以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性神经元。

1.5 图像分析 每只小鼠随机选取5张切片,每张切片随机选取4个视野,在同一视场面积,同一放大倍数,同一背景光强度下采集图像,运用美国Mc公司Image-Pro Plus 6.0软件统计TH阳性神经元数量以及测定GSK-3β阳性反应物积分光密度。

2 结 果

2.1 敞箱实验 敞箱实验检测显示,模型组小鼠水平运动、垂直运动活性较正常对照组显著降低(P＜0.05);依达拉奉治疗后,运动活性较模型组有了显著改善(P＜0.05),但与正常对照组间仍存在显著差异(P＜0.05),见表1。

表1 各组小鼠水平运动、垂直运动比较(±s,n=10)

表1 各组小鼠水平运动、垂直运动比较(±s,n=10)

组别 水平运动 垂直运动正常对照组 120.33±5.85 18.667±3.08模型组 70.833±8.47 9.16±1.17依达拉奉治疗组 100.4±20.24 12.2±0.84

2.2 TH免疫组织化学染色 TH免疫组织化学染色结果显示(图1):正常对照组小鼠在中脑腹侧黑质致密部和腹侧被盖区可见许多TH阳性神经元(107.83±7.885),细胞多为锥体形和三角形,胞浆内棕色颗粒浓;模型组小鼠黑质致密部和腹侧被盖区TH阳性细胞显著减少(36.17±4.082),较正常组减少约66.5%,胞浆内染色极为浅淡。依达拉奉治疗后TH阳性细胞有了显著回升,但数量上仍比正常对照组少(84.67±4.082),且染色也较正常对照组浅淡。

图1 各组小鼠黑质TH免疫组织化学染色(SABC法,×100)

2.3 GSK-3β免疫组织化学染色 GSK-3β免疫组织化学染色结果显示(图2):正常对照组小鼠黑质神经元胞浆呈淡棕色,GSK-3β积分光密度值较低(0.195 14±0.006 98),蛋白表达水平较低;模型组大量胞浆呈深棕色,GSK-3β积分光密度值显著升高(0.284 92±0.008 60),蛋白高表达。依达拉奉治疗后GSK-3β蛋白表达显著降低(0.243 39±0.004 91)。

图2 各组小鼠黑质GSK-3β免疫组织化学染色(SABC法,×400)

3 讨 论

近年来由于除草剂等环境毒素在乡村的大量使用,乡村PD的发病率呈现上升趋势。环境毒素在PD中的作用日益受到关注。百草枯是世界上最为常用的除草剂之一,由于其化学结构与MPTP的活性物质MPP+(一种非自然产生的神经毒素,能够引起人类及动物产生帕金森病)极为相似,自2007年起已经被美国等13个国家禁用或限用,但在我国仍广泛使用〔4〕。代森锰是一种除真菌剂,与百草枯的使用存在地域上的重叠,能够加剧多巴胺神经元的丢失和运动障碍〔5〕。因此,联合百草枯与代森锰建立小鼠PD模型,既符合我国国情,又符合PD多环境因素致病的学说。

GSK-3β是一种多功能的丝氨酸/酪氨酸酶,广泛分布于哺乳动物脑组织,涉及wnt、PI3K/AKT,G蛋白复合受体等信号传导通路,通过磷酸化代谢酶、信号蛋白、结构蛋白和转录因子,参与细胞命运的调控,与PD等神经退行性疾病的发生密切相关〔6〕。GSK-3β现已被作为糖尿病、阿尔茨海默病等多种疾病的治疗靶标〔7〕。Takashima 等〔8〕在阿尔茨海默病、FTDP-17 等神经退行性疾病的研究中发现,激活GSK-3β导致神经纤维缠结形成和神经元丢失;抑制GSK-3β将抑制神经纤维缠结形成和神经元丢失。基于上述研究,GSK-3β抑制剂成为了当前AD和其他神经退行性病药物治疗的发展方向。本实验研究结果显示,依达拉奉能够显著改善百草枯联合代森锰引起的小鼠运动能力减退,黑质多巴胺神经元数量减少和GSK-3β表达增高。可见,依达拉奉对PD有较好的治疗作用,其机制可能是通过抑制GSK-3β的表达,进而抑制黑质神经元凋亡,这与 Wu等〔9〕通过促红细胞生成素(EPO)抑制GSK-3β活性,降低 caspase-3表达,从而保护PC12细胞免受MPP+引起的细胞凋亡相一致。虽然依达拉奉可能成为PD治疗比较有希望的选择,但仍然有很多关键的问题还不清楚,如治疗的最佳时机和剂量等,还有待于进一步的研究。

1 Shichinohe H,Kuroda S,Yasuda H,et al.Neuroprotective effects of the free radical scavenger Edaravone(MCI-186)in mice permanent focal brain ischemia〔J〕.Brain Res,2004;1029(2):200-6.

2 Bates B,Hirt L,Thomas SS,et al.Neurotrophin-3 promotes cell death induced in cerebral ischemia,oxygen-glucose deprivation,and oxidative stress:possible involvement of oxygen free radicals〔J〕.Neurobiol Dis,2002;9(1):24-37.

3 Chen JX,Zhao T,Huang DX.Protective effects of edaravone against cobalt chloride-induced apoptosis in PC12 cells〔J〕.Neurosci Bull,2009;25(2):67-74.

4 Cicchetti F,Drouin-Ouellet J,Gross RE.Environmental toxins and Parkinson′s disease:what have we learned from pesticide-induced animal models〔J〕？Trends Pharmacol Sci,2009;30(9):475-83.

5 Fei Q,Ethell DW.Maneb potentiates paraquat neurotoxicity by inducing key Bcl-2 family members〔J〕.J Neurochem,2008;105(6):2091-7.

6 Takashima A.Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta(GSK-3beta)-mediated signal transduction pathway:role of GSK-3beta in adult brain〔J〕.J Pharmacol Sci,2009;109(2):174-8.

7 Ojo KK,Gillespie JR,Riechers AJ,et al.Glycogen synthase kinase 3 is a potential drug target for African trypanosomiasis therapy 〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2008;52(10):3710-7.

8 Takashima A.GSK-3 is essential in the pathogenesis of Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimers Dis,2006;9(3):309-17.

9 Wu Y,Shang Y,Sun S,et al.Erythropoietin prevents PC12 cells from 1-methyl-4-phenylpyridinium ion-induced apoptosis via the Akt/GSK-3beta/caspase-3 mediated signaling pathway〔J〕.Apoptosis,2007;12(8):1365-75.