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X染色体连锁的凋亡抑制蛋白对米非司酮诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

2011-07-29汤飒爽

中国药业 2011年17期
关键词:司酮孕激素质粒

汤飒爽

(浙江省台州市路桥中医院,浙江 台州 318000)

细胞凋亡研究是近年来生命科学研究的重点之一。X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)属于凋亡抑制蛋白家族IAPs中8个成员中的一员。XIAP是其中抑制凋亡最有力的成员,相对分子质量为57000,基因定位于Xq25,是含有497个氨基酸的蛋白,N-末端含有3个BIR(baculovirus IAP repeat)结构域(BIR1,BIR2,BIR3)。XIAP 通过与 caspase-3,caspase-6,caspase-7直接结合,进一步抑制caspase的激活,从而抑制细胞凋亡;BIR3区可直接与caspase-9前体-C-末端的亚单位结合,抑制caspase-9的激活[1];XIAP还可通过核因子-κB(NF-κB)途径上调 XIAP,c-IAP1,c-IAP2,抑制 caspases的激活,阻断细胞凋亡。另外,许多学者发现,雌、孕激素与其受体的相互作用在妇科恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用,并在某种程度上反映患者的预后。米非司酮(mifepristone)系人工合成的类固醇激素,为强效受体水平的孕激素受体拮抗剂、糖皮质激素受体拮抗剂,主要用于终止早期妊娠。近年来,研究发现米非司酮还具有抗肿瘤作用,可用于子宫肌瘤、子宫内膜异位症、妇科恶性肿瘤、脑膜瘤、胶质瘤、前列腺癌等疾病的治疗。宫颈癌是妇女常见恶性肿瘤之一。为了研究XIAP在HeLa细胞中的作用,本研究利用共聚焦荧光显微镜观察细胞内荧光分布情况,用米非司酮诱导凋亡,以流式细胞术检测细胞凋亡状况,初步探讨了XIAP对宫颈癌HeLa细胞的影响及其相互作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌细胞系HeLa(购自ATCC),由遵义医学院中心实验室传代。空质粒pEGFPN1,pDsRed2-N1及其构建的重组质粒pEGFP-XIAP,pDsRed2-XIAP,由遵义医学院病理实验室保存。LipofectionTM2000(Invitrogen公司)。米非司酮购自浙江仙琚制药股份有限公司;AnnexinⅤ-FITC购自晶美公司,流式细胞仪(BDFACBCalibur公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养

取宫颈癌细胞系HeLa,培养于含10%新鲜小牛血清的RPMI 1640培养基中,置37℃和5%CO2、相对湿度90%的培养箱中培养,细胞呈贴壁生长。

1.2.2 质粒提取与鉴定

于LB培养液中加入硫酸卡那霉素(50 μg/mL);分别取150 μL pDsRed2-N1,pDsRed2-XIAP加入LB培养液中,于恒温摇床中摇菌,质粒提取,存于-80℃冰箱中。采用紫外分光光度计对DNA进行定量分析,根据 A260/A280的比值反映DNA的纯度,比值大于1.8且小于2.0时纯度较高。重组质粒酶切反应时,各试剂加入配制反应体系,37℃孵育2 h,1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 重组质粒转染人宫颈癌细胞系(HeLa)

细胞转染步骤:转染前24 h,经细胞计数,用无血清的培养基培养。转染时细胞在培养板中生长至60% ~80%。配置溶液A(4 μg质粒DNA用转染培养基加至250 μL)和B(10 μL LipofectionTM2000用转染培养基加至250 μL),室温放置5 min,混匀 A液和 B液,室温下放置 20 min。将500 μL复合物加入培养液中,37℃孵育6 h后,换成新鲜的有血清培养基,于37℃继续孵育,24~48 h后可观察到报告基因的表达。

对贴壁生长的HeLa细胞分组:未处理组为常规培养的HeLa细胞;药物对照组为加米非司酮终浓度40μmol/L;空白对照A组为转染pDsRed2-N1质粒无米非司酮处理,空白对照B组为转染pDsRed2-XIAP融合质粒无米非司酮处理组;试验A组为转染pDsRed2-N1质粒+米非司酮,试验B组为转染pDsRed2-XIAP融合质粒+米非司酮。加药组均于37℃培养48 h,加入米非司酮4 h后收集细胞。

1.2.4 细胞凋亡状况与转染细胞效率检测

细胞凋亡状况:分别收集6组细胞,1000 r/min离心5 min,用冰预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次;重悬于4×Binding Buffer,使细胞密度为 1×106/mL;于 100 μL细胞悬液中加入 AnnexinⅤ-FITC 5 μL,室温避光孵育 15 min;加入磷酸盐缓冲液 100 μL,在流式细胞仪上检测。

转染细胞效率:将转染pDsRed2-XIAP融合质粒的细胞于37℃和5%CO2条件下培养48 h,收集细胞,转移至离心管;加入磷酸盐缓冲液200 μL,在流式细胞仪上检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 重组质粒酶切反应电泳图

pEGFP-XIAP,pDsRed2-XIAP融合蛋白表达质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ酶切后,可见与XIAP片段大小相符的产物条带,电泳结果见图1。

图1 重组质粒酶切反应电泳图

2.2 激光扫描共聚集显微镜图像

未转染、转染空质粒、转染pDsRed2-XIAP融合蛋白的HeLa细胞激光扫描共聚焦显微镜下观察,图像见图2。

图2 激光扫描共聚焦显微镜图像

由图2 C可见,转染pDsRed2-XIAP融合蛋白的HeLa细胞呈多边形,在激光扫描共聚焦显微镜下见大量细胞阳性表达,pDsRed2-XIAP融合蛋白弥漫分布于细胞浆和细胞核,在543 nm激发波长下可见565 nm发射波长下清晰的红色荧光。

2.3 转染细胞效率

经流式细胞仪检测,pDsRed2-XIAP融合蛋白在HeLa细胞中的转染率为52.35%。

2.4 HeLa细胞凋亡情况

流式细胞仪检测结果见表1。结果显示,米非司酮能诱导HeLa细胞凋亡,XIAP可抑制由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡。

3 讨论

研究宫颈癌Hela细胞内抑凋亡因子XIAP的特点以及药物的干预作用,将为了解宫颈癌的发生机制、治疗途径提供基础。Samuel等[2]通过细胞分级分离试验(cell fractionation experiments)发现,XIAP存在于HeLa细胞的胞浆内,后来他们利用免疫荧光染色发现部分HeLa细胞的胞核中也存在XIAP的蛋白表达。XIAP对caspase-3的抑制作用,主要通过结合caspase-3的底物结合位点竞争性抑制了caspase-3的活性,可通过BIR1与BIR2之间的接头域抑制caspase-7的活性,另外还可通过BIR3结构域抑制caspase-9,进而在上游阻止了caspase-3的活性,达到阻断细胞凋亡的作用[3-6]。XIAP还可以通过NF-κB途径抑制细胞凋亡,通过上调 XIAP,抑制caspase的激活,从而抑制细胞凋亡[1,7]。

表1 米非司酮药物处理后HeLa细胞凋亡率的比较(,n=3)

表1 米非司酮药物处理后HeLa细胞凋亡率的比较(,n=3)

注:与药物对照组比较,*P <0.05。

组别未处理组空白对照A组空白对照B组药物对照组试验A组试验B组细胞凋亡率(%)0.06 ±0.04*5.62 ±0.40*9.29 ±2.45*46.08 ±2.7348.68 ±0.6126.11 ±0.5*处理方法未处理转染pDsRed2-N1质粒转染pDsRed2-XIAP融合质粒米非司酮处理转染pDsRed2-N1质粒+米非司酮处理转染pDsRed2-XIAP融合质粒+米非司酮处理

本次研究发现,在米非司酮的诱导下,转染XIAP的HeLa细胞凋亡率比转染空质粒的Hela细胞凋亡率明显降低,说明XIAP可抑制由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡。笔者认为,XIAP可能通过直接抑制 caspase-3,caspase-6或 caspase-7的激活,抑制 HeLa细胞凋亡;或通过其自身的BIR3,从上游阻断caspase-9的催化活性,导致细胞凋亡率下降;还可能催化自身及靶蛋白,通过泛素化而降解,并降解与其结合的caspase[8],从而增强抑制凋亡活性。

米非司酮的抗肿瘤作用,最初认为主要与其抗孕激素作用有关。米非司酮通过以下多种机制发挥抗肿瘤作用:通过调节bcl-2,bax,waf-1等凋亡相关基因的表达,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖;诱导细胞分化;通过拮抗药源性或内源性孕激素对血管内皮生长因子(VEGF)及其mRNA的上调作用,抑制VEGF生成;调节细胞周期,将细胞的增殖阻止于G1期;下调巨噬细胞集落刺激因子受体的表达,抑制肿瘤细胞的转移;通过调节蛋白激酶C信号转导通路的相关蛋白阻断神经酞胺糖基化,提高肿瘤细胞对相关化学治疗药物的敏感性。流行病学调查和临床资料分析显示,人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与宫颈癌密切相关。80%的宫颈癌中人乳头瘤病毒基因组与宿主基因组整合,使E6/E7癌性蛋白过度表达,从而分别使抑癌基因p53/pRb失活,细胞生长失控发生癌变。基因能促进HPV-16中E6/E7癌基因的转录,米非司酮可阻断孕激素对癌基因的作用,米非司酮还能阻断人乳头瘤病毒基因组的整合与转录[9]。因此米非司酮在宫颈癌的治疗中,尤其在阻断人乳头瘤病毒基因组与宿主基因组发生整合的早期宫颈癌变的治疗中,将起到重要的作用。米非司酮是唯一应用于临床的孕激素拮抗剂,在药物人工流产方面已取得满意疗效。为此,将米非司酮作用于人宫颈癌HeLa细胞株,观察其对HeLa细胞凋亡的作用。试验结果显示,米非司酮能有效诱导HeLa细胞凋亡。由此可见,米非司酮可望成为临床上治疗宫颈癌的辅助用药,并且其在HeLa细胞中的作用机制可能与XIAP有关,但它们具体的结合方式、作用途径尚需进一步研究,还可以通过体内研究包括动物实验及临床研究来进一步探讨米非司酮对宫颈癌的治疗作用。

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